Wir haben eine einfache Methode zur Lipophilitätsmessung von frenetischen Verbindungen mit Fluor NMR entwickelt, die acrid genug ist, um zu reproduzieren wir kleine Unterschiede in der Lipophilie messen. Diese Methode kann verwendet werden, um systematisch die Auswirkungen der Bildung von organischen Verbindungen auf die gelösten veränderungen der Lipophilität zu untersuchen, die in der allgemeinen medizinischen Chemie von Interesse ist. Vorteile dieser Methode sind, dass Verbindungen müssen nicht reaktiv sein, und sie müssen nicht völlig rein sein.
Es besteht keine Notwendigkeit, genaue Masse oder Volumen zu messen, und es besteht keine Notwendigkeit, Kalibrierkurven zu erstellen. Es sollte eine geeignete Referenzverbindung gewählt werden, und eine Kreuzkontamination des Aliquot sollte während der Probenahmephase vermieden werden. In diesem Video zeigen wir ihnen die entsprechenden praktischen Fähigkeiten für Probenahme, NMR-Rohrversiegelung und den korrekten Einsatz von NMR-Software für die Datenverarbeitung.
Fügen Sie 6,0 Milligramm Compound X und 3,0 Milligramm der Referenzverbindung zu einem 10 Milliliter birnenförmigen Kolben hinzu. Lösen Sie die Verbindungen in etwa zwei Milliliter HPLC-Grade n-Octanol auf und fügen Sie zwei Milliliter HPLC-Wasser hinzu. Legen Sie die Kolben in eine temperaturgeregelte Aufnahme über einer Rührplatte und verbinden Sie sie mit einem Umwälzkühler.
Die biphasische Mischung bei 25 Grad Celsius zwei Stunden rühren, wobei die Rührgeschwindigkeit auf 600 RPM eingestellt ist. Gleichgewichte die Mischung bei 25 Grad Celsius über Nacht, um eine vollständige Phasentrennung zu ermöglichen. Befestigen Sie den Kolben mit einer Klemme an einem Retortenständer.
Nehmen Sie ein Aliquot von etwa 0,70 bis 0,85 Milliliter aus Wasser- und n-Octanol-Schichten, indem Sie eine Milliliter Einweg-Plastikspritzen mit langen Nadeln verwenden. Für die Einnahme des Wassers aliquot, ziehen Sie etwa 0,02 Milliliter Luft in die Spritze, bevor Sie die Nadel in die Mischung. Während Sie die Nadel durch die obere n-Octanol-Schicht in die Wasserschicht bewegen, drücken Sie die Luft vorsichtig heraus, um zu verhindern, dass die n-Octanol-Lösung in die Nadel eindringt.
Entfernen Sie die lange Nadel aus der Mischung. Entsorgen Sie eine kleine Menge Wasserprobe, so dass etwa 0,6 Milliliter der Probe in der Spritze verbleiben. Wischen Sie die Nadel vorsichtig mit trockenem Gewebe ab und injizieren Sie etwa 0,5 Milliliter der Wasserprobe in ein sauberes NMR-Rohr.
Schließen Sie das NMR-Rohr schnell mit einer Kappe. Für die n-Octanol-Probe die lange Nadel aus der n-Octanol-Schicht entfernen. Entsorgen Sie eine kleine Menge n-Octanol-Probe, so dass etwa 0,6 Milliliter der Probe in der Spritze zurückbleiben.
Nach sorgfältigem Abwischen der Nadel mit trockenem Gewebe, injizieren Sie etwa 0,5 Milliliter der n-Octanol-Probe in ein sauberes NMR-Rohr. Schließen Sie das NMR-Rohr schnell mit einer Kappe. Überprüfen Sie sowohl n-Octanol als auch Wasserproben visuell auf Verunreinigungen aus der anderen Phase.
Zu jedem NMR-Rohr 0,1 Milliliter eines deuterated NMR-Lösungsmittels hinzufügen, das sowohl mit n-Octanol als auch mit Wasser mischbar ist, um die Signalsperre während der NMR-Erfassung zu ermöglichen. Bei Verbindungen mit niedrigen Siedepunkten die NMR-Rohre mit einer Blaslampe versiegeln und nach dem Abkühlen das Rohr invertieren, um Leckagen zu überprüfen. Um die versiegelten oder nicht versiegelten NMR-Rohre 20 Mal sorgfältig umzukehren, um eine homogene Lösung für F19-NMR-Experimente zu erhalten.
Führen Sie proton entkoppelte Fluor-NMR-Experimente durch, um chemische Verschiebungen von Compound X und der Referenzverbindung sowohl in n-Octanol- als auch in Wasser-NMR-Proben zu identifizieren. Verwenden Sie die Im Textprotokoll aufgeführten NMR-Standardparametereinstellungen. Messen Sie die Spin-Gitter-Entspannungszeit (T1) für diagnostische Fluorkerne mithilfe einer Inversionsrückgewinnungssequenz.
Messen Sie den Grad der geeigneten Pulsverzögerungszeit anhand der erhaltenen T1-Werte für eine genaue quantitative NMR-Integration. Führen Sie ein schnelles F19 H1-Spektrum aus, um die Anfangsparameter einzurichten. Messen Sie die 90-Grad-Pulsbreite, legen Sie dann den Parameter für das T1-Messexperiment fest, und führen Sie das T1-Messexperiment mit einer Inversionsrückgewinnungssequenz aus.
Führen Sie erneut protonentkoppelte Fluor-NMR-Experimente mit angepassten Parametereinstellungen durch. Stellen Sie D1 ein und zentrieren Sie den Frequenzversatzpunkt zwischen den beiden diagnostischen Fluorsignalen, sodass beide Kerne gleichmäßig angeregt werden können. Legen Sie außerdem die Spektralbreite auf 300 PPM fest, und legen Sie die Anzahl der Transienten auf 64 fest.
Passen Sie diese Werte an, wenn ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis erforderlich ist. Verarbeiten Sie die erhaltenen Daten mit ACD NMR Processor Academic Edition oder einer anderen benutzerdefinierten NMR-Verarbeitungssoftware. Öffnen Sie die NMR-Datendatei.
Öffnen Sie dann den Ordner pdata, gefolgt vom Ordner 1. Löschen Sie die 1r-Datei. Kehren Sie zur NMR-Datendatei zurück, und ziehen Sie die FID-Datei in das ACD-NMR-Prozessorfenster.
Klicken Sie auf die Fensterfunktionsschaltfläche, wählen Sie exponentielle, legen Sie den Linienerweiterungswert als zwei fest, und klicken Sie auf die Schaltfläche okay. Klicken Sie nun auf die Schaltfläche Nullfüllung, erhöhen Sie die Anzahl der Punkte auf das Vierfache der ursprünglichen Punkteanzahl, indem Sie auf eine kleine Schaltfläche neben der Zahl klicken, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Okay". Wählen Sie die Fourier-Transformationsschaltfläche aus.
Klicken Sie als Nächstes auf die Phasenschaltfläche, und klicken Sie dann auf die Maus-Phasing-Schaltfläche. Klicken und halten Sie die linke Maustaste, und fahren Sie fort, die Maus vorwärts oder rückwärts zu bewegen, bis der Hauptgipfel des Spektrums ordnungsgemäß gestaffelt ist. Klicken und halten Sie nun die rechte Maustaste gedrückt und bewegen Sie die Maus vorwärts oder rückwärts, bis die anderen Spitzen des Spektrums ordnungsgemäß gestaffelt sind.
Klicken Sie dann auf die Maus-Phasing-Taste und zoomen Sie mit den Fluorspitzen in den Spektralbereich. Klicken Sie auf Feinabstimmung, führen Sie die Phasenkorrektur bei Bedarf wie zuvor beschrieben durch, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Tick". Klicken Sie auf die Baseline-Schaltfläche und dann auf die Optionsschaltfläche.
Wählen Sie die Spektrummittelung für automatische Modelle aus, passen Sie bei Bedarf die Anzahl der Punkte für die Halbe Breite des Feldes an. Klicken Sie auf okay, auto, und klicken Sie dann auf die Tick-Schaltfläche. Klicken Sie als Nächstes auf Integration, integrieren Sie die diagnostischen Fluorspitzen, und klicken Sie auf die Tick-Schaltfläche.
Schließlich erhalten Sie die Integrationsverhältnisse aus n-Octanol- und Wasser-NMR-Proben und verwenden sie in der logP-Berechnungsgleichung, um den logP-Wert von Compound X zu erhalten. Anschließend wurde die Lipophilie von zwei Fluorethanolen erneut bestimmt, jedoch mit 3, 3, 3, 2, 2-Pentafluorpropanol als Referenz. Der gemessene logP-Wert betrug 0,76, wobei im Vergleich zu dem mit 2-2-2-Trifluorethanol als Referenz gemessenen Wert nur eine Differenz von 0,01 logP-Einheiten aufwies.
Ebenso ist bei cis-2, 3-difluro-1, 4-Butan-Diol der Unterschied der gemessenen LogP-Werte unter Verwendung von zwei Fluorethanol und seinem Transisomer sehr gering. Dies zeigt eine gute Reproduzierbarkeit, und dass die Auswahl von Referenzverbindung keine Auswirkungen auf die logP-Messung hat. Weitere ausgewählte Beispiele werden hier gezeigt.
Alle diese nicht-UV-aktiven allophatischen Verbindungen, von fluorierten Kohlenhydraten bis hin zu Fluorhydrinen, können mit dieser Methode leicht gemessen werden. Andere Proto-NMR-basierte Methoden können verwendet werden, wenn Ihre Verbindung kein Fluor enthält, und wenn die Verbindung UV-Chromofor enthält, dann kann die logP-Messung mit UV-Quantifizierung durchgeführt werden. Die Lipophilität einer breiten Palette von nicht-UV-aktiven Fluorhydrinen und deoxifluonierten Kohlenhydraten wurde gemessen.
Die erhaltene Datenbibliothek wurde verwendet, um Trends und Regeln für die Auswirkungen der aliphatischen Fluorierung auf die Lipophilität zu bestimmen. Octanol und Wasser stellen minimale Sicherheitsrisiken dar. Natürlich sollten die Gefahren, die gemessen werden, und die Referenzverbindung immer berücksichtigt werden.
