Dieses Geheimnis kann helfen, einige Fragen auf dem Gebiet der Zellbiologie zu beantworten, wie proteininput in Chloroplasten. Der Hauptvorteil dieser Technologie besteht darin, dass der Proteineintrag in Chloroplasten unter en vivo-Bedingungen untersucht werden kann. Demonstrieren datieren das Verfahren werden Junho Lee und Hyangju Kang, zwei Post-Outs aus meinem Labor.
Zu Beginn, Ernten Sie intakte Blattgewebe von zwei Wochen alten Pflanzen von einem bis zwei B5-Platten. Verwenden Sie ein chirurgisches Messer, um die Blätter zu ernten und legen Sie sie in eine 50 Milliliter konische Röhre mit 25 Milliliter Enzymlösung. Das Rohr horizontal auf einen Drehschüttler legen und mit sanfter Rührung bei 22 Grad Celsius im Dunkeln acht bis zwölf Stunden lang bebrüten, bis nur noch Petioles und Stiele in der Lösung verbleiben.
Filtern Sie nach Abschluss der Inkubation die Enzymlösung, die freigesetzte Protoplaste enthält, durch ein 140 Mikrometer porengroßes Netz in eine frische Petrischale. Dann die Lösung sorgfältig auf 15 Milliliter 21%Saccharoselösung in einem 50 Milliliter konischen Rohr schichten. Zentrifugieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 98 g für 10 Minuten mit den niedrigsten Beschleunigungs- und Verzögerungseinstellungen.
Danach verwenden Sie PaturaPipetten, um die Protoplaste sorgfältig aus der obersten Schicht, die Enzymlösung enthält, und aus der Schnittstelle zwischen der Enzymlösung und der Saccharoselösung zu entfernen. Übertragen Sie diese Lösung in ein 50 Milliliter konisches Rohr mit 30 Milliliter W5 Lösung und invertieren Sie das Rohr zu mischen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 51 g für sechs Minuten.
Verwenden Sie eine Pipette, um diesen Überstand sorgfältig zu entsorgen, ohne die Protoplaste im Pellet zu stören. Fügen Sie 25 Milliliter W5-Lösung hinzu und hängen Sie die Protoplasten vorsichtig wieder auf. Zur Stabilisierung mindestens eine Stunde in einem Vier-Grad-Kühlschrank brüten.
Nach vier Grad Celsius Inkubation, Pellet die Protoplaste vollständig durch Zentrifugieren sie bei 46 g für zwei Minuten. Entfernen Sie den Überstand sorgfältig und fügen Sie dem Protoplastpellet eine MANG-Lösung hinzu, um fünfmal zehn bis sechs Pro Milliliter zu erreichen. Verwenden Sie eine Pipette, um 10 Mikrogramm der Plasma-DNA und 300 Mikroliter Protoplastlösung zu einem frischen 13 Milliliter runden Röhrchen hinzuzufügen.
Mischen Sie die Rohre vorsichtig von Hand und fügen Sie dann sofort 300 Mikroliter frisch zubereitete 40%PEG-Lösung hinzu. Mischen Sie das Rohr vollständig, indem Sie das Rohr fast horizontal kippen und es mehrmals von Hand sanft drehen. Bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
Dann fügen Sie einen Milliliter W5-Lösung hinzu und mischen Sie vollständig, indem Sie das Rohr vorsichtig von Hand drehen. Inkubieren Sie die Probe für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie zwei weitere Male mit dem Hinzufügen von zuerst 1,5 Milliliter und dann zwei Milliliter W5 und nach dem letzten Hinzufügen und Mischen, inkubieren für 30 Minuten.
Zentrifugieren Sie das Rohr vier Minuten lang bei 46 g und entsorgen Sie dann den Überstand. Fügen Sie zwei Milliliter W5-Lösung in das Pellet und mischen Sie sanft, aber vollständig, in der gleichen Weise wie zuvor. Inkubieren Bei 22 Grad Celsius in einer dunklen Kammer für 18 Stunden.
Um den Proteinimport mittels Floreszenzmikroskopie zu analysieren, verwenden Sie eine Pipette mit einer getrimmten Spitze, um 10 Mikroliter der Protoplastlösung auf einem Glasschlitten zu platzieren. Verwenden Sie einen Abdeckzettel, um die Lösung sorgfältig abzudecken, um eine Beschädigung der Protoplaste zu vermeiden. Platzieren Sie die Folie auf der Bühne eines Fluoreszenzmikroskops mit einem Anregungsaufnahmefilter, der für die Beobachtung von grünem fluoreszierendem Protein und Chlorophyll-Autofluoreszenz eingestellt ist.
Verwenden Sie eine gekühlte Ladepaar-Gerätekamera, um Bilder zu erfassen und sie mit einer Software zur Bearbeitung von Pseudofarben zu verarbeiten. Für die gesamte Proteinextraktion und Immunoblotting, entfernen Sie einen Milliliter aus der Protoplastlösung und mischen Sie die restlichen einen Milliliter. Diese Protoplastlösung vier Minuten lang in ein Zentrifugenrohr und eine Zentrifuge mit 46 g geben.
Entfernen Sie den Überstand nach Abschluss der Zentrifugation und fügen Sie 80 Mikroliter Denaturierungspuffer hinzu. Wirbel für fünf Sekunden. Fügen Sie fünf XDS-Probenpuffer hinzu, mischen Sie gut und kochen Sie für 10 Minuten, um zu denaturieren.
Fahren Sie mit der Standard-STS-Seite und der Immunoblotting mit Anti-GFP-Antikörper. RbcS und TGFT, ein Fusionskonstrukt, das die 79 End-Terminal-Aminosäurerückstände von RBCS kodiert, die das mit GFP verschmolzene Transitpeptid enthalten, wurde verwendet, um den Import von Proteinen in Chloroplasten durch Floreszenzmikroskopie und Immunoblotting zu untersuchen. Bei der Untersuchung durch Floreszenzmikroskopie verschmolzen grüne fluoreszierende Signale des Zielproteins mit den roten fluoreszierenden Signalen der Chlorophyll-Autofloreszenz, die auf den Proteinimport in Chloroplasten hinweisen.
Nach der Isolierung des Gesamtproteins werden im Immunoblot zwei Proteinbänder beobachtet, die zeigen, dass ein Protein ordnungsgemäß in Chloroplasten eingeführt wurde. Das obere Band entspricht dem Vorläufer in voller Länge und dem unteren Band der verarbeiteten Form nach dem Import in Chloroplasten. Die Menge der verarbeiteten Form des Proteins erhöhte sich zeitabhängig, was darauf hindeutet, dass das Protein in Chloroplasten eingeführt wird.
Bei dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, um Proteinermüdung oder Membranfadenpickung in Arabidopsis zu erforschen.
