Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Biochemie zu beantworten, wie die proteolytische Modifikation von Proteinen, sowie die Charakterisierung von Inhibitoren und Proteasen und Peptidasen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie ein schnelles Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen auf Peptiden ermöglicht, die die Spaltseite des gegebenen Proteins darstellen. Hier wird proteases untersucht, die die virale Fusion aktivieren.
Der erste Schritt in der Peptid-Design ist die Sequenz des Fusionsproteins von Interesse aus einer öffentlichen Datenbank wie NCBI oder der Virus-Pathogen-Datenbank zu erwerben. Wählen Sie die Protease-Erkennungsstelle, die das Fusionspeptid fortfährt, und schließen Sie zwei bis drei Aminosäuren vor und nach dieser Sequenz ein. Bei der Bestellung des Peptids, ändern Sie es mit der Fluoreszenz Resonanz Energieübertragung oder FRET-Paar, Mca an der Endstation und Dnp an der c Endstation.
Während des Assays ist Mca aufgeregt und gibt Lichtenergie ab, die von Dnp abgeschreckt wird, solange sich das Paar in unmittelbarer Nähe zueinander befindet. Wenn jedoch eine Spaltung auftritt, kann Dnp die Emission, die dann vom Fluoreszenzplattenleser gelesen werden kann, nicht löschen. Setzen Sie das Peptid gemäß den Empfehlungen der Hersteller wieder auf, indem Sie sanft nach oben und unten pfeifen.
Zum Beispiel in 70% Ethanol auf eine Endkonzentration von einem Millimolar wieder anhalten. Wenn das Peptid nicht sehr gut durch Pipettieren wieder aufhält, legen Sie das Rohr, das das Peptid und das Lösungsmittel enthält, in ein Beschallungsbad, bis es vollständig resuspendiert ist. 100 Mikroliter Aliquots des Peptids in leichte dämpfungs- oder widerstandsfähige Schläuche geben, um das Peptid vor Bleichen zu schützen.
Bewahren Sie die Aliquots bei minus 20 Grad Celsius auf. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie den Plattenleser einschalten und warten, bis der Selbsttest abgeschlossen ist. Öffnen Sie anschließend die Bediensoftware am angeschlossenen Computer und stellen Sie sicher, dass sie mit dem Plattenleser verbunden ist.
Öffnen Sie die Temperatureinstellung und stellen Sie sie auf die erforderliche Temperatur für eine optimale Leistung für die Protease, die 30 Grad Celsius beträgt, in diesem Fall. Um das Experiment einzurichten, klicken Sie auf die Einrichtung des Steuerungsinstruments, wählen Sie kinetisch aus, und wählen Sie dann Fluoreszenz aus. Geben Sie eine Anregungswellenlänge von 330 Nanometern und eine Emissionswellenlänge von 390 Nanometern ein.
Deaktivieren Sie die automatische Abschaltung und wählen Sie die mittlere/normale Empfindlichkeit aus. Wählen Sie eine Laufzeit von einer Stunde für den Test und wählen Sie alle 60 Sekunden eine Messung aus. Legen Sie fünf Sekunden Mischen vor der ersten Messung und drei Sekunden vor jeder Messung fest.
Wählen Sie schließlich die zu lesenden Brunnen aus. Bereiten Sie die entsprechenden Testpuffer für die Proteasen vor, wie im Textprotokoll beschrieben, und kühlen Sie die Puffer auf Eis. Legen Sie eine massive schwarze Polystyrol unbehandelte flache Boden 96-Well-Platte auf Eis mit einer dünnen Metallplatte darunter, um Kühlung und Stabilität zu unterstützen.
Es ist wichtig, eine schwarze Platte als Assayplatte zu verwenden, um fluoreszierende Leckagen aus angrenzenden Brunnen zu verhindern. Pro Peptid drei technische Replikationen pro Assay und ein Gesamtvolumen von 100 Mikroliterpro Probe vorbereiten. Pipette die entsprechende Menge an Assay-Puffer in jeden Brunnen der Assay-Platte.
Fügen Sie 0,5 Mikroliter Protease zu jedem Brunnen hinzu. Auf sechs Brunnen, fügen Sie 0,5 Mikroliter Puffer anstelle der jeweiligen Protease. Drei davon sind Blindkontrollen und die anderen drei Peptidkontrollen.
Fügen Sie fünf Mikroliter des Peptids zu einer Endkonzentration von 50 Mikromolar zu jedem Brunnen, mit Ausnahme der Blindkontrollen. Zu jedem der drei blinden Kontrollbrunnen, fügen Sie fünf Mikroliter Puffer anstelle von Peptid. Legen Sie die Platte in den mehligen Tellerleser ein und klicken Sie auf Start.
Speichern Sie vor dem Starten der Datenanalyse die Experimentierdatei. Klicken Sie auf Exportieren, und exportieren Sie die Datei als txt. Importieren Sie die txt-Datei in eine Kalkulationstabelle.
Starten Sie die Analyse, indem Sie ein Diagramm erstellen und die relativen Fluoreszenzeinheiten auf der y-Achse mit der Zeit auf der x-Achse für jede technische Replikation pro Probe darstellen. Wählen Sie den Datenbereich aus, in dem sich das Diagramm in einem linearen Bereich befindet und der dem Beginn der Fluoreszenzerhöhung am nächsten liegt. Zeichnen Sie die ausgewählten Daten in einem zweiten Diagramm, und fügen Sie eine lineare Trendlinie hinzu.
Wählen Sie in den Trendlinienoptionen die Anzeigegleichung im Diagramm aus. Die Gleichung zeigt V max, was der Neigung der Trendlinie entspricht. Berechnen Sie den durchschnittlichen V-Höchstwert für jede Probe aus den drei technischen Replikationen.
Nachdem Sie das Experiment zweimal wiederholt haben, um drei biologische Replikationen zu erhalten, berechnen Sie die Standardabweichung auf der Grundlage der Daten aus den drei unabhängigen biologischen Replikationen. Ein Furinspaltungstest des humanen MERS-Coronavirus, emc/2012 S2 prime site und des Kamel-abgeleiteten Doppelmutanten-Stamms HKU205 sowie einzelner mutierter Varianten von EMC/2012 ergaben, dass das EMV/2012-Peptid effizient gespaltet wurde, während fast keine Spaltung des S2-Prime-Peptids von HKU205 auftrat. Die Spaltung des eMV/2012 A-S mutierten S2-Prime-Peptids wurde stark reduziert, und es gab fast keine Spaltung des EMV/2012 S zu I mutiertem S2-Prime-Peptid.
Ein weiterer Furinspaltungstest zeigte im Vergleich zum humanen MERS-Coronavirus, EMC/2012 S2 Prime Site, nur minimale Spaltung der von Kamelen abgeleiteten Marokko 213 S2-Spitzenstelle. Furinspaltung wurde bei dem prototypischen S1/S2-Peptid, FECV I und 4 S1/S2 beobachtet, jedoch nicht beim mutierten S1/S2-Peptid, FIPV I Black S1/S2. In ähnlicher Weise war Furin in der Lage, das prototypische S2 Prime Peptid, FECV II 1683 S2 prime zu spalten, aber nicht die mutierten S2 Prime Peptide, FECV I und 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime und FIPV II 1146 S2 prime.
Nach diesem Verfahren können Western-Blot-Analysen oder Aminofluoreszenz-Assays durchgeführt werden, bei denen das proteinreiche Protein in voller Länge verwendet wird, um die Proteinspaltung zu überprüfen, oder in diesem Fall, wenn die Spaltung zu einer fusogenen Version des viralen Fusionsproteins führt.
