이 방법은 단백질의 단백질 분해 변형과 같은 생화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 억제제 및 프로테아제 및 펩티다아제의 특성화에 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 주어진 단백질의 분열 면을 나타내는 펩티드에 대한 프로테아제의 프로테올리틱 활성의 신속한 스크리닝을 허용한다는 것입니다. 여기서 사용 하 여 바이러스 성 융합을 활성화 하는 proteases를 공부 하는.
펩티드 설계의 첫 번째 단계는 NCBI 또는 바이러스 병원균 데이터베이스와 같은 공공 데이터베이스로부터 관심있는 융합 단백질의 서열을 획득하는 것이다. 융합 펩티드를 진행 하는 프로테아제 인식 부위를 선택하고 이 서열의 상류 및 하류에 2~3개의 아미노산을 포함한다. 펩티드를 주문할 때, 형광 공명 에너지 전달 또는 FRET 쌍, 종기에서 Mca 및 C 종점에서 Dnp로 수정한다.
분석 하는 동안, Mca 흥분 하 고 쌍 서로 가까운 에 있는 Dnp에 의해 담금질 가벼운 에너지를 방출. 그러나, 분열이 발생하면, Dnp는 형광판 판독기에 의해 읽을 수 있는 방출을 담금질할 수 없습니다. 제조사의 권고에 따라 펩티드를 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 다시 중단합니다.
예를 들어 70%에탄올에서 1밀리알러의 최종 농도로 재중단합니다. 펩티드가 파이펫팅으로 아주 잘 재중단되지 않으면 펩티드와 용매를 함유한 튜브를 완전히 다시 중단될 때까지 초음파 처리 욕조에 놓습니다. 펩타이드의 100마이크로리터 알리쿼트를 가벼운 감쇠 또는 내성 튜브에 분배하여 펩티드를 표백으로부터 보호합니다.
알리코를 영하 20도에 보관하십시오. 플레이트 판독기를 켜고 자체 테스트가 완료될 때까지 기다리는 것으로 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 연결된 컴퓨터에서 작동 소프트웨어를 열고 플레이트 판독기와 연결되어 있는지 확인합니다.
이 경우 온도 설정을 열고 섭씨 30도인 프로테아제의 최적의 성능을 위해 필요한 온도로 설정합니다. 실험을 설정하려면 제어 기기 설정을 클릭하고 운동을 선택한 다음 형광을 선택합니다. 330 나노미터의 난동과 390 나노미터의 방출 파장을 입력합니다.
자동 컷오프를 선택 취소하고 중간/일반 감도를 선택합니다. 분석의 경우 1시간의 런타임을 선택하고 60초마다 하나의 측정값을 선택합니다. 첫 번째 측정 전에 5초 의 혼합을 설정하고 각 측정 전에 3 초 를 설정합니다.
마지막으로 읽을 우물을 선택합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 프로테아제에 적합한 분석 버퍼를 준비하고 얼음의 버퍼를 냉각합니다. 냉각과 안정성을 지원하기 위해 얇은 금속 판이 있는 단단한 검은색 폴리스티렌 처리되지 않은 평평한 바닥 96웰 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.
인접한 우물에서 형광 누출을 방지하기 위해 흑색 판을 분석 판으로 사용하는 것이 필수적입니다. 펩타이드당 분석당 3개의 기술적 복제와 시료당 총 100마이크로리터를 준비한다. 피펫 분석 플레이트의 각 우물에 적당량의 분석 버퍼.
각 웰에 프로테아제 0.5 마이크로리터를 추가합니다. 6개의 우물에 각각의 프로테아제 대신 버퍼0.5 마이크로리터를 추가합니다. 이들 중 3개는 블라인드 컨트롤이 될 것이며 나머지 3개는 펩티드 컨트롤이 될 것입니다.
블라인드 컨트롤을 제외한 각 웰에 50 마이크로몰라의 최종 농도에 펩티드의 5마이크로리터를 첨가한다. 세 가지 블라인드 컨트롤 웰 각각에 펩타이드 대신 완충제 5마이크로리터를 추가합니다. 접시를 밀가루판 판독기에 삽입하고 시작을 클릭합니다.
데이터 분석을 시작하기 전에 실험 파일을 저장합니다. 내보내기를 클릭하고 파일을 txt로 내보냅니다. txt 파일을 스프레드시트에 가져옵니다.
그래프를 생성하여 샘플을 당 각 기술 복제에 대해 x축의 시간에 대해 y축의 상대형 형광 단위를 플로팅하여 분석을 시작합니다. 그래프가 선형 범위에 있는 데이터 범위를 선택하고 형광의 시작에 가장 가까운 데이터 범위를 선택합니다. 두 번째 그래프에서 선택한 데이터를 플롯하고 선형 추세선을 추가합니다.
추세선 옵션에서 차트에서 표시 방정식을 선택합니다. 방정식은 추세선의 경사에 해당하는 V max를 표시합니다. 세 가지 기술 복제에서 각 샘플의 평균 V 최대를 계산합니다.
실험을 두 번 더 반복한 후, 3개의 생물학적 복제를 얻기 위해, 3개의 독립적인 생물학적 복제로부터의 데이터를 기반으로 표준 편차를 계산한다. 인간 MERS 코로나바이러스, EMC/2012 S2 프라임 사이트 및 낙타 유래 이중 돌연변이 균주 HKU205의 후린 분열 분석, EMC/2012의 단일 돌연변이 변종과 함께 EMC/2012 펩타이드는 HKU2의 S2 프라임 펩타이드의 거의 분열이 발생하지 않았지만 효율적으로 절단된 것으로 나타났습니다. EMC/2012 A-S 돌연변이 S2 프라임 펩타이드의 골짜기는 강하게 감소하였고, EMC/2012 S의 분열이 거의 없었기 때문에 S2 프라임 펩티드를 돌연변이시켰다.
또 다른 furin 분열 분석은 인간 MERS 코로나바이러스, EMC/2012 S2 프라임 사이트에 비해 낙타 유래 모로코 213 S2 프라임 사이트의 최소한의 골짜기만을 보였다. 후린 골짜기는 프로토타입 S1/S2 펩타이드, FECV I 및 4 S1/S2에 대해 관찰되었지만 돌연변이된 S1/S2 펩타이드, FIPV I 블랙 S1/S2에서는 관찰되었다. 유사하게, 후린은 프로토 타입 S2 프라임 펩티드, FECV II 1683 S2 프라임을 절단 할 수 있었지만, 돌연변이 S2 프라임 펩티드, FECV I 및 4 S2 프라임, FIPV I 블랙 S2 프라임, 및 FIPV II 1146 S2 프라임.
이 절차에 따라, 서양 블롯 분석 또는 아미노 형광 분석, 관심의 전체 길이 단백질을 사용하여 단백질 분열을 검증하기 위해 수행 될 수있다, 또는이 경우, 분열이 바이러스 성 융합 단백질의 후생 버전을 초래하는 경우.
