Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biochimie, telles que la modification protéolytique des protéines, ainsi que la caractérisation des inhibiteurs et des protéases et peptidases. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un dépistage rapide de l’activité protéolytique des protéases sur les peptides, représentant le côté clivage de la protéine donnée. L’utilisation ici est d’étudier les protéases qui activent la fusion virale.
La première étape de la conception du peptide consiste à acquérir la séquence de la protéine de fusion d’intérêt à partir d’une base de données publique comme ncbi ou la base de données sur les pathogènes du virus. Choisissez le site de reconnaissance de la protéase procédant au peptide de fusion et incluez deux à trois acides aminés en amont et en aval de cette séquence. Lors de la commande du peptide, modifiez-le avec le transfert d’énergie par résonance fluorescence ou la paire FRET, Mca au terminus d’extrémité et Dnp au terminus c.
Pendant l’analyse, Mca est excité et émet de l’énergie lumineuse qui est trempée par Dnp tant que la paire est à proximité les uns des autres. Toutefois, si le clivage se produit, Dnp ne sera pas en mesure d’étancher l’émission qui peut ensuite être lu par le lecteur de plaque de fluorescence. Resuspendez le peptide selon les recommandations des fabricants en pipetting doucement de haut en bas.
Par exemple, resuspendez dans 70% d’éthanol à une concentration finale d’un millimolaire. Si le peptide ne se résusue pas très bien par pipetage, placez le tube contenant le peptide et le solvant dans un bain de sonication jusqu’à ce qu’il soit entièrement résuspendé. Distribuez 100 aliquots microlitres du peptide dans des tubes légers amortissants ou résistants pour protéger le peptide du blanchiment.
Conservez les aliquots à moins 20 degrés Celsius. Commencez cette procédure en allumer le lecteur de plaque et en attendant que l’auto-test soit terminé. Ensuite, ouvrez le logiciel d’exploitation sur l’ordinateur ci-joint et assurez-vous qu’il est connecté avec le lecteur de plaque.
Ouvrez le réglage de la température et réglez-le à la température requise pour une performance optimale pour la protéase, qui est de 30 degrés Celsius, dans ce cas. Pour configurer l’expérience, cliquez sur la mise en place de l’instrument de commande, choisissez cinétique, puis sélectionnez fluorescence. Entrez une longueur d’onde d’excitation de 330 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 390 nanomètres.
Désélectionner le cut-off automatique et sélectionner la sensibilité moyenne/normale. Choisissez un temps de course d’une heure pour l’analyse et sélectionnez une mesure toutes les 60 secondes. Réglez cinq secondes de mélange avant la première mesure, et trois secondes avant chaque mesure.
Enfin, sélectionnez les puits à lire. Préparez les tampons d’analyse appropriés pour les protéases décrites dans le protocole de texte et refroidissez les tampons sur la glace. Placez une plaque de 96 puits en polystyrène noir massif non traitée sur la glace avec une mince plaque métallique en dessous pour soutenir le refroidissement et la stabilité.
Il est essentiel d’utiliser une plaque noire comme plaque d’essai, pour éviter les fuites fluorescentes des puits adjacents. Par peptide, préparer trois répliques techniques par essai, et un volume total de 100 microlitres par échantillon. Pipette la quantité appropriée de tampon d’essai dans chaque puits de la plaque d’essai.
Ajouter 0,5 microlitres de protéase à chaque puits. À six puits, ajouter 0,5 microlitres de tampon au lieu de la protéase respective. Trois d’entre eux seront des contrôles aveugles et les trois autres seront des contrôles peptidique.
Ajouter cinq microlitres du peptide à une concentration finale de 50 micromolaires à chaque puits, à l’exception des commandes aveugles. À chacun des trois puits de contrôle aveugle, ajouter cinq microlitres de tampon au lieu de peptide. Insérez l’assiette dans le lecteur de plaque flourescents et cliquez sur démarrer.
Avant de commencer l’analyse des données, enregistrez le fichier d’expérience. Cliquez sur l’exportation, et exportez le fichier comme un txt. Importez le fichier txt dans une feuille de calcul.
Commencez l’analyse en créant un graphique, en traçant les unités fluorescentes relatives sur l’axe Y par rapport au temps sur l’axe x pour chaque réplique technique par échantillon. Sélectionnez la plage de données où le graphique se trouve dans une plage linéaire, et la plus proche du début de l’augmentation de fluorescence. Tracez les données sélectionnées sur un deuxième graphique et ajoutez une ligne de tendance linéaire.
Dans les options de ligne de tendance, sélectionnez l’équation d’affichage sur le graphique. L’équation montrera V max, qui correspond à la pente de la ligne de tendance. Calculez le V max moyen pour chaque échantillon à partir des trois répliques techniques.
Après avoir répété l’expérience deux fois de plus, pour obtenir trois répliques biologiques, calculer l’écart type basé sur les données des trois répliques biologiques indépendantes. Un essai de clivage de furin du coronavirus humain de MERS, du site principal d’EMC/2012 de S2, et de la souche double mutante HKU205 dérivée de chameau, avec des variantes mutantes simples d’EMC/2012 a indiqué que le peptide d’EMC/2012 a été efficacement fendillé, alors que presque aucun clivage du peptide premier S2 de HKU205 s’est produit. Le clivage du peptide principal S2 muté EMC/2012 A-S a été fortement réduit, et il n’y avait presque aucun clivage de l’EMC/2012 S à I muté peptide principal de S2.
Un autre test de clivage de furin n’a montré qu’un clivage minimal du site principal du Maroc 213 S2 dérivé du chameau, comparé au coronavirus humain MERS, emc/2012 S2 site principal. Le clivage de furin a été observé pour le peptide prototypique de S1/S2, FECV I et 4 S1/S2, mais pas dans le peptide muté de S1/S2, FIPV I Black S1/S2. De même, furin a été en mesure de fendre le peptide prototypique S2 premier, FECV II 1683 S2 premier, mais pas les peptides mutés S2 premier, FECV I et 4 S2 premier, FIPV I Black S2 premier, et FIPV II 1146 S2 premier.
Après cette procédure, l’analyse occidentale de tache ou les analyses d’amino-fluorescence, utilisant la protéine pleine longueur d’intérêt peut être exécutée pour vérifier le clivage de protéine, ou dans ce cas, si le clivage a comme conséquence une version fusogenic de la protéine virale de fusion.
