この方法は、タンパク質のタンパク質分解修飾、阻害剤、プロテアーゼおよびペプチダーゼの特性化など、生化学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ペプチドに対するプロテアーゼのタンパク質分解活性を迅速にスクリーニングし、所与のタンパク質の切断側を表す点である。ここでの使用は、ウイルス融合を活性化するプロテアーゼを研究することです。
ペプチド設計の第一歩は、NCBIやウイルス病原体データベースなどの公的データベースから目的の融合タンパク質の配列を取得することです。融合ペプチドを進めるプロテアーゼ認識部位を選択し、この配列の上流および下流に2〜3個のアミノ酸を含む。ペプチドをオーダーする場合、蛍光共鳴エネルギー移動またはFRET対、末端のマカ、c末端のDnpで修飾する。
アッセイの間、Mcaは興奮し、ペアが互いに近くにある限り、Dnpによって消光される光エネルギーを放出する。しかし、切断が発生した場合、Dnpは蛍光プレートリーダーによって読み取ることができる発光をクエンチすることができない。製造業者の推奨に従って、上下に軽くピペットを入れ替えることによって、ペプチドを再懸濁します。
例えば、70%エタノール中で1ミリモルの最終濃度に再懸濁する。ペプチドがピペット処理によってあまりよく再懸濁しない場合は、完全に再懸濁されるまで、ペプチドと溶媒を含むチューブを超音波浴中に入れる。ペプチドの100マイクロリットルのアリコートを光減衰または耐性チューブに分配し、ペプチドを漂白から保護します。
アリコートをマイナス20度で保管してください。この手順を開始するには、プレート リーダーの電源を入れ、セルフ テストが終了するまで待ちます。次に、接続されているコンピュータでオペレーティングソフトウェアを開き、プレートリーダーに接続されていることを確認します。
温度設定を開き、必要な温度に設定して、プロテアーゼ(摂氏30度)を最適にする場合は、この場合に使用してください。実験をセットアップするには、制御器のセットアップをクリックし、運動を選択して蛍光を選択します。励起波長330ナノメートル、発光波長390ナノメートルを入力します。
自動カットオフの選択を解除し、中/通常の感度を選択します。アッセイの実行時間を1時間選択し、60秒ごとに1つの測定値を選択します。最初の測定の前に5秒間、各測定の3秒前に混合を設定します。
最後に、読み取る井戸を選択します。テキストプロトコルに記載されているように、プロテアーゼに適したアッセイバッファーを準備し、氷上のバッファーを冷やします。冷却と安定性を支えるために、氷の上に固体黒いポリスチレン非処理フラットボトム96ウェルプレートを下に薄い金属板を置きます。
隣接するウェルからの蛍光漏れを防ぐためには、アッセイプレートとして黒板を使用することが不可欠です。ペプチドごとに、アッセイあたり3つの技術的複製を調製し、サンプルあたり100マイクロリットルの合計体積を調製する。アッセイプレートの各ウェルに適量のアッセイバッファーをピペットする。
各ウェルに0.5マイクロリットルのプロテアーゼを加えます。6つのウェルに、それぞれのプロテアーゼの代わりに0.5マイクロリットルのバッファーを加えます。これらのうちの3つはブラインドコントロールであり、他の3つはペプチドコントロールになります。
5マイクロリットルのペプチドを各ウェルに50マイクロモルの最終濃度に加えます( ブラインドコントロールを除く)。3つのブラインドコントロールウェルのそれぞれに、ペプチドの代わりに5マイクロリットルのバッファーを加えます。プレートを小麦粉プレートリーダーに挿入し、[開始]をクリックします。
データ分析を開始する前に、実験ファイルを保存します。エクスポートをクリックし、ファイルを txt としてエクスポートします。txt ファイルをスプレッドシートにインポートします。
分析を開始するには、グラフを作成し、サンプルごとの技術反復ごとに、Y軸上の相対的な蛍光単位をx軸上の時間に対してプロットします。グラフが線形範囲にあるデータ範囲を選択し、蛍光の開始に最も近い値を選択します。選択したデータを 2 番目のグラフにプロットし、線形傾向線を追加します。
傾向線のオプションで、チャート上の数式を表示するを選択します。方程式は、トレンドラインの傾きに対応するV maxを示します。3 つの技術反復から各サンプルの平均 V max を計算します。
実験を2回以上繰り返した後、3つの生物学的複製物を得て、3つの独立した生物学的複製からのデータに基づいて標準偏差を算出する。ヒトMERSコロナウイルス、EMC/2012 S2プライムサイト、ラクダ由来の二重変異株HKU205のフリン切断アッセイは、EMC/2012の単一突然変異変異体変異体と共に、EMC/2012ペプチドが効率的に切断されたことを明らかにしたが、HKU205のS2プライムペプチドの切断はほとんど起こらなかった。EMC/2012 A-S変異S2プライムペプチドの切断は大幅に減少し、EMC/2012 SからIに変異したS2プライムペプチドの切断はほとんどなかった。
別のフリン切断アッセイは、ラクダ由来のモロッコ213 S2プライムサイトの最小切断のみを示し、ヒトMERSコロナウイルス、EMC/2012 S2プライムサイトと比較した。プロトタイプS1/S2ペプチド、FECV Iおよび4 S1/S2についてはフリン切断が認められたが、変異したS1/S2ペプチド、FIPV IブラックS1/S2では観察されなかった。同様に、フリンは原型S2プライムペプチドを切断することができたが、FECV II 1683 S2プライムは、変異したS2プライムペプチドではなく、FECV Iおよび4 S2プライム、FIPV IブラックS2プライム、およびFIPV II 1146 S2プライムである。
この手順に従って、ウェスタンブロット分析またはアミノ蛍光アッセイは、目的の全長タンパク質を使用してタンパク質切断を検証し、この場合、切断がウイルス融合タンパク質のフソジェニックバージョンをもたらす場合に行うことができる。
