Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биохимии, такие как протеолитическое изменение белков, а также характеристика ингибиторов и протеаз и пептиды. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет быстро скрининг протеолитической активности протеаз на пептидах, представляющих собой расщепление стороны данного белка. Использование здесь заключается в изучении протеаз, которые активируют вирусный синтез.
Первым шагом в разработке пептидов является приобретение последовательности синтезного белка, представляющих интерес, из общедоступной базы данных, такой как NCBI или база данных патогенов вируса. Выберите сайт распознавания протеазы, продолжая синтез пептида и включают в себя два-три аминокислоты вверх по течению и вниз по течению этой последовательности. При заказе пептида, изменить его с флуоресценции резонанс передачи энергии или FRET пары, Мака в конце срока и Dnp на c терминуса.
Во время анализа, Мака возбуждается и излучает световую энергию, которая угасает Dnp до тех пор, как пара находится в непосредственной близости друг от друга. Однако, если расщепление происходит, Dnp не сможет утолить выбросы, которые затем могут быть прочитаны считывателем пластины флуоресценции. Resuspend пептид в соответствии с рекомендациями производителей, мягко трубы вверх и вниз.
Например, повторное потребление 70% этанола до конечной концентрации одного миллимолара. Если пептид не resuspend очень наилучшим образом pipetting, то поместите пробку содержа пептид и растворитель в sonication ванне до тех пор пока она полно resuspended. Раздай 100 микролитровых алицитов пептида в легкие увлажняющие или устойчивые трубки для защиты пептида от отбеливания.
Храните aliquots при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Начните эту процедуру, включив считыватель пластин и ожидая, пока самоте тест будет закончен. Затем откройте операционное программное обеспечение на прикрепленном компьютере и убедитесь, что оно подключено к считыватель пластин.
Откройте температуру настройки и установите ее до требуемой температуры для оптимальной производительности для протеазы, которая составляет 30 градусов по Цельсию, в этом случае. Чтобы настроить эксперимент, нажмите на настройку инструмента управления, выберите кинетическую, а затем выберите флуоресценцию. Введите восклицательный длина волны 330 нанометров и длину волны выбросов 390 нанометров.
Неизбирать автоматическое отключаемое и выберите среду/нормальную чувствительность. Выберите время времени времени времени времени 1 часа для анализа и выберите одно измерение каждые 60 секунд. Установите пять секунд смешивания перед первым измерением и за три секунды до каждого измерения.
Наконец, выберите колодцы для чтения. Подготовь соответствующие буферы анализа для протеасов, как описано в текстовом протоколе, и охладите буферы на льду. Поместите твердый черный полистирол необработавной плоской нижней 96-хорошо пластины на льду с тонкой металлической пластиной под для поддержки охлаждения и стабильности.
Важно использовать черную пластину в качестве анализной пластины, чтобы предотвратить утечку флуоресцентных ламп из соседних скважин. За пептид, подготовить три технических репликаций на анализ, и общий объем 100 микролитров на образец. Pipette соответствующее количество анализа буфера в каждой хорошо анализ пластины.
Добавьте 0,5 микролитров протеазы к каждой колодец. К шести скважинам добавьте 0,5 микролитров буфера вместо соответствующей протеазы. Три из них будут слепые элементы управления, а остальные три будут пептид управления.
Добавьте пять микролитров пептида к окончательной концентрации 50 микромолеров к каждой колодец, за исключением слепого контроля. К каждой из трех слепых контрольных скважин добавьте пять микролитров буфера вместо пептида. Вставьте пластину в мучные пластины читателя и нажмите кнопку начала.
Перед началом анализа данных сохраните файл эксперимента. Нажмите на экспорт, и экспортировать файл в качестве txt. Импорт файла txt в электронную таблицу.
Начните анализ с создания графика, построения относительных флуоресцентных единиц на оси y против времени на x-оси для каждого технического репликации на образец. Выберите диапазон данных, где график находится в линейном диапазоне, и ближе всего к началу увеличения флуоресценции. Участок выбранных данных на втором графике и добавить линейную линию тренда.
В вариантах линии тренда выберите уравнение отображения на графике. Уравнение покажет V max, что соответствует наклону линии тренда. Рассчитайте средний V макс для каждого образца из трех технических репликаций.
Повторив эксперимент еще дважды, чтобы получить три биологические репликации, вычислите стандартное отклонение на основе данных из трех независимых биологических репликаций. Анализ расщепления фурина коронавируса ЧЕЛОВЕКА MERS, EMC/2012 S2 prime site, и верблюжьего штамма HKU205, а также отдельных мутантных вариантов EMC/2012 показали, что пептид EMC/2012 был эффективно расщеплен, в то время как почти не произошло расщепления главного пептида S2 HKU205. Расщепление EMC/2012 A-S мутировал S2 премьер пептид был сильно сокращен, и почти не было расщепления EMC/2012 S, чтобы я мутировал S2 премьер пептид.
Другой анализ расщепления фурина показал лишь минимальное расщепление верблюда, полученного из Марокко 213 S2, по сравнению с коронавирусом MERS человека, EMC/2012 S2 prime site. Расщепление фурина наблюдалось для прототипа пептида S1/S2, FECV I и 4 S1/S2, но не в мутировавшем пептиде S1/S2, FIPV I Black S1/S2. Аналогичным образом, фурин был в состоянии расщеплять прототип S2 премьер пептид, FECV II 1683 S2 премьер, но не мутировал S2 премьер пептиды, FECV I и 4 S2 премьер, FIPV I Черный S2 премьер, и FIPV II 1146 S2 премьер.
После этой процедуры, западный анализ помарки или анализ amino-fluorescence, используя протеин полной длины интереса можно выработать для того чтобы проверить расщепление протеина, или в этом случае, если расщепление приводит к в fusogenic варианте вирусного протеина сплавливания.
