Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la bioquímica, como la modificación proteolítica de proteínas, así como la caracterización de inhibidores y proteasas y peptidasas. La principal ventaja de esta técnica es que permite un cribado rápido de la actividad proteolítica de las proteasas en péptidos, representando el lado de escisión de la proteína dada. El uso aquí es estudiar las proteasas que activan la fusión viral.
El primer paso en el diseño de péptidos es adquirir la secuencia de la proteína de fusión de interés de una base de datos pública como NCBI o la base de datos de patógenos del virus. Elija el sitio de reconocimiento de proteasa que procede del péptido de fusión e incluya de dos a tres aminoácidos aguas arriba y aguas abajo de esta secuencia. Al ordenar el péptido, modifíquelo con la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o par FRET, Mca en la terminal final y Dnp en la terminal c.
Durante el ensayo, Mca se excita y emite energía lumíña que es sofocada por Dnp mientras el par esté cerca uno del otro. Sin embargo, si se produce un escote, Dnp no podrá apagar la emisión que luego puede ser leída por el lector de placas de fluorescencia. Resuspender el péptido de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes por pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo.
Por ejemplo, resuspend en 70%etanol a una concentración final de un milimolar. Si el péptido no se resuspía muy bien por pipeteo, coloque el tubo que contiene el péptido y el disolvente en un baño de sonicación hasta que se resuspend. Dispensar 100 microlitros alícuotas del péptido en tubos de amortiguación de luz o resistentes para proteger el péptido del blanqueo.
Almacene las alícuotas a menos 20 grados centígrados. Comience este procedimiento encendiendo el lector de placas y esperando hasta que finalice la autoprueba. A continuación, abra el software operativo en el ordenador conectado y asegúrese de que está conectado con el lector de placas.
Abra el ajuste de temperatura y establézcalo en la temperatura requerida para un rendimiento óptimo para la proteasa, que es de 30 grados centígrados, en este caso. Para configurar el experimento, haga clic en la configuración del instrumento de control, elija cinética y, a continuación, seleccione fluorescencia. Introduzca una longitud de onda de excitación de 330 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 390 nanómetros.
Anule la selección del corte automático y seleccione la sensibilidad media/normal. Elija un tiempo de ejecución de una hora para el ensayo y seleccione una medida cada 60 segundos. Establezca cinco segundos de mezcla antes de la primera medición y tres segundos antes de cada medición.
Por último, seleccione los pozos que desea leer. Prepare los búferes de ensayo adecuados para las proteasas como se describe en el protocolo de texto y enfríe los búferes sobre hielo. Coloque una placa plana de 96 pocillos de fondo plano no tratada de poliestireno negro sólido sobre hielo con una placa metálica delgada debajo para apoyar el enfriamiento y la estabilidad.
Es esencial utilizar una placa negra como placa de ensayo, para evitar fugas fluorescentes de pozos adyacentes. Por péptido, prepare tres réplicas técnicas por ensayo y un volumen total de 100 microlitros por muestra. Pipetear la cantidad adecuada de tampón de ensayo en cada pozo de la placa de ensayo.
Añadir 0,5 microlitros de proteasa a cada pozo. A seis pozos, agregue 0,5 microlitros de tampón en lugar de la proteasa respectiva. Tres de ellos serán controles ciegos y los otros tres serán controles de péptidos.
Añadir cinco microlitros del péptido a una concentración final de 50 micromolares a cada pozo, excepto los controles ciegos. A cada uno de los tres pozos de control ciego, agregue cinco microlitros de tampón en lugar de péptido. Inserte la placa en el lector de placas de harina y haga clic en iniciar.
Antes de iniciar el análisis de datos, guarde el archivo de experimento. Haga clic en exportar y exporte el archivo como un archivo txt. Importe el archivo txt a una hoja de cálculo.
Inicie el análisis creando un gráfico, trazando las unidades fluorescentes relativas en el eje Y con el tiempo en el eje X para cada réplica técnica por muestra. Seleccione el rango de datos donde el gráfico está en un rango lineal y el más cercano al inicio del aumento de fluorescencia. Trazar los datos seleccionados en un segundo gráfico y añadir una línea de tendencia lineal.
En las opciones de línea de tendencia, seleccione la ecuación de visualización en el gráfico. La ecuación mostrará V max, que corresponde a la pendiente de la línea de tendencia. Calcule el promedio de V máximo para cada muestra a partir de las tres réplicas técnicas.
Después de repetir el experimento dos veces más, para obtener tres réplicas biológicas, calcule la desviación estándar basada en los datos de las tres réplicas biológicas independientes. Un ensayo de escisión de furin de coronavirus de MERS humano, sitio principal DE EMC/2012 S2 y cepa de doble mutante derivada de camellos HKU205, junto con variantes mutantes individuales de EMC/2012 revelaron que el péptido EMC/2012 fue cebado eficientemente, mientras que casi no se produjo ninguna escisión del péptido principal S2 de HKU205. El escote del péptido principal S2 mutado EMC/2012 A-S se redujo fuertemente, y casi no hubo escote del péptido primo EMC/2012 S a I mutado S2.
Otro ensayo de escisión de furin mostró sólo un escote mínimo del sitio principal Marruecos 213 S2 derivado de camellos, en comparación con el coronavirus humano MERS, sitio principal EMC/2012 S2. Se observó escote de furin para el péptido prototípico S1/S2, FECV I y 4 S1/S2, pero no en el péptido S1/S2 mutado, FIPV I Negro S1/S2. Del mismo modo, el furin fue capaz de cortar el péptido primo prototípico S2, FECV II 1683 S2 primo, pero no los péptidos primos S2 mutados, FECV I y 4 S2 primo, FIPV I Black S2 primo, y FIPV II 1146 S2 primo.
Después de este procedimiento, se puede realizar un análisis de manchas occidentales o ensayos de aminofluorescencia, utilizando la proteína de longitud completa de interés para verificar la escisión proteica, o en este caso, si la escisión da lugar a una versión fusogénica de la proteína de fusión viral.
