Dieses Protokoll demonstriert eine neuartige Methode zur Multiplex-Genombearbeitung von Saccharomyces cerevisiae durch die Einführung mehrerer Expressionskassetten auf verschiedenen Loci in einem einzigen Transformationsschritt. Dieser Klon-Freie-Plasmid-Montageansatz zur Exdinierung eines einzelnen crRNA-Arrays führt zu einem schnellen, effizienten und flexiblen Genom-Editing-Protokoll. Wir werden wilde Hefezellen entwickeln, um Carotinoide zu produzieren, indem wir freie heterologe Gene auf freie genomische Loci einführen.
Das einzelne crRNA-Array besteht aus freien individuellen crRNAs, die aus RNA-Polymerase-freiem Promotor exprimiert werden. Cas12a verarbeitet in vivo das crRNA-Array in einzelne crRNAs. Die crRNAs führen Cas12a zum Ziel-Loci auf der genomischen DNA, wo Cas12a doppelStrangbrüche einführt.
DNA-Fragmente nach unten rekombinieren für die In-vivo-Rekombination und integrieren sich in die genomische DNA. Demonstriert wird das Protokoll von Klaudia Ciurkot, einer Doktorandin. Jeffery van Wijk, an Associate Scientist.
Und Brenda Vonk, Senior Associate Scientist aus unserem Labor. Nachdem Sie ein einzelnes crRNA-Array für Multiplex Genome Editing-Experimente synthetischer DNA erhalten haben, bereiten Sie den PCR-Amplifikationsmix vor und laden Sie das Array zur Amplifikation in den Thermocycler. Um die PCR-Produkte durch Elektrophorese zu analysieren, führen Sie die Proben 40 Minuten lang auf einem 0,8%agarose Gel bei 5 V/cm aus.
Laden Sie die DNA-Leiter mit den DNA-Fragmenten von 100 10000 Basenpaaren und reinigen Sie dann die PCR-Produkte mit einem PCR-Reinigungskit nach den Anweisungen des Herstellers. Für die Hefetransformation beginnen Sie mit der Vorkultivierung von Wildhefe in einem 100 ml Kolben, der 20 ml Hefeextrakt Pepton-Dextrose oder YEPD-Medium enthält. Für eine nächtliche Inkubation bei 30 Grad Celsius und 250 Umdrehungen pro Minute Am nächsten Morgen impfen Sie 20 ml frisches YEPD-Medium mit einem berechneten Volumen an über Nacht vorkulturbezogener Hefe.
Platzieren Sie die Kultur in einem Schüttelinkubator, bis eine optische Dichte von 1,0, gemessen bei 600 Nanometern, erreicht ist. Ernten Sie die Hefezellen durch Zentrifugation. Waschen Sie das Hefezellpellet in 20 ml Raumtemperatur demineralisiertes Wasser, gefolgt von einer zusätzlichen Zentrifugation.
Setzen Sie das Pellet in 100 Mikroliter Lithiumacetat Tris-EDTA Lösung aus und übertragen Sie die Hefe in ein Mikrozentrifugenrohr. Mischen Sie fünf Mikroliter einsträngiger Träger-DNA und ein Mikrogramm Plasmid pCSN067 mit der Hefezellsuspension. Mischen Sie dann 600 Mikroliter Polyethylenglykol LiAc-TE Lösung mit der Probe.
Die Hefezellen und das Plasmid 30 Minuten bei 30 Grad Celsius und 450 Prm in einem Wärmeblock auf dem Tisch bebrüten. Am Ende der Inkubation 70 ml Dimethylsulfoxid mit der Transformationslösung mischen. Hitze schockieren die Mischung für 15 Minuten in einem 42 Grad Celsius Wasserbad.
Übertragen Sie das Gemisch in ein 15 ml rundes Unterrohr. Fügen Sie 10 ml YEPD in die Röhre für eine nächtliche Inkubation bei 30 Grad Celsius und 250 U/min. Am nächsten Morgen sammeln Sie die transformierten Zellen durch Zentrifugation und aspirieren alle bis auf die letzten 200 Mikroliter des Überstandes.
Setzen Sie das transformierte Hefezellpellet im verbleibenden Überstand wieder auf. Platte 150 Mikroliter des Transformationsmixes und 150 Mikroliter einer 20-fachen Verdünnung der verbleibenden 50 Mikroliter Transformationsmischung in YEPD, auf YEPD-Agarplatten, ergänzt mit 0,2 Gramm pro Liter G418. Nach 48 bis 72 Stunden bei 30 Grad Celsius, wählen Sie ein einziges Transformant für die Erneute Streaking auf einer neuen YEPD Agar Platte mit 0,2 g/L von G418 ergänzt.
Für die zweite Transformation, wachsen die Kultur auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 1,0, wie gerade gezeigt. Und fügen Sie 20 Mikroliter Zellen zu einem Mikrozentrifugenrohr hinzu. Nach der Zentrifugation das Zellpellet in 100 Mikroliter LiAc-TE-Lösung wieder aufsetzen und ssDNA hinzufügen.
Kombinieren Sie in einem separaten Rohr ein Mikrogramm des einzelnen crRNA-Arrays, ein Mikrogramm des linearisierten Empfängerplasmids für das crRNA-Array, ein Mikrogramm jeder Spender-DNA und ein Mikrogramm jeder flankierenden Region. Übertragen Sie dann das DNA-Gemisch in das Rohr kompetenter Hefezellen und schließen Sie die zweite Transformation ab, wie für die erste Transformation gezeigt. Am nächsten Morgen sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und suspendieren sie das Pellet in einem kleinen Aliquot von Überstand.
Dann Platte 150 Mikroliter der Transformationsmischung, und 150 Mikroliter einer 20-fachen Verdünnung des Transformationsmixes im YEPD-Medium auf YEPD-Agarplatten, ergänzt durch 0,2 g/L G418, und 0,2 g/L Nourseothricin Nach 48 bis 72 Stunden bei 30 Grad Celsius wählen Sie ein einfarbiges Transformant zum Nachstreichen auf einer neuen YEPD-Platte, um einfarbige Kolonien zu erhalten. Um die Effizienz der Genombearbeitung zu bestimmen, zählen Sie die Anzahl der farbigen und weißen Kolonien auf den Transformationsplatten und teilen Sie die Anzahl der farbigen Kolonien durch die Gesamtzahl der Kolonien. Um Hefe-Pixel-Kunst zu erzeugen, impfen Sie einzelne 500 ml-Shake-Kolben mit 100 ml YEPD-Medium mit drei verschiedenfarbigen Carotinoid-Produktions-S.cerevisiae-Stämmen und einem wilden Typ CEN.
PK113-7D-Stamm. Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 30 Grad Celsius mit Schütteln bei 250 Rpm. Übertragen Sie 0,5 ml jeder Nachtkultur auf einzelne Röhren, die 0,5 ml steriles, nichtionisches Dichtegradientenmedium pro Rohr enthalten, und mischen Sie die Lösungen kurz durch Wirbeln.
Übertragen Sie die Zellsuspensionen in einzelne, qualifizierte Reservoir 2 von 3 Brunnen. Verwenden Sie eine csv-Datei mit der Flüssigkeitskalibrierungseinstellung 6RES_AQ_GPSA2 auf einem akustischen Flüssigkeitshandler-Instrument, um 25 Nanoliter jedes S.cerevisiae-Stamms von der entsprechenden qualifizierten Reservoir-Quellplatte auf eine 6144-Well-Destination-Mikroplatte mit 50 ml YEPD-Agar zu erkennen. Wenn alle Brunnen gesichtet wurden, inkubieren Sie die Mikroplatte bei 30 Degress Celsius für 48 Stunden.
Um die Farben der Stämme zu intensivieren, lagern Sie die Agarplatten bei 4 Grad Celsius für mindestens 72 Stunden. Ein Bild von Rosalind Franklin ist auf dem Teller aufgetaucht. Wie gezeigt, können Promoter, offener Leserahmen, Terminator und zwei zusammenhängende 50 bp-Steckverbindersequenzen über eine Golden Gate-Klonreaktion zu einer Ausdruckskassette zusammengebaut und von PCR überprüft werden.
Nach der Verstärkung des einzelnen crRNA-Arrays durch PCR wird das Empfängerplasmid für das einzelne crRNA-Array linearisiert, wie durch Elektrophorese bestätigt. Die Effizienz der Multiplex GenomE Editing kann durch den Prozentsatz der farbigen Kolonien nach der Transformation und durch die Ergebnisse von PCR-Analysen berechnet werden, die die Integration von Spender-DNA an den beabsichtigten genomischen DNA-Standorten bestätigen. So wurde beispielsweise ausgehend von einem Schwarz-Weiß-Bild von Rosalind Franklin eine vierfarbige Bild- und Spotting-Liste erstellt, die dann verwendet wurde, um die vier verschiedenen Hefestämme auf einer Agar-Mikroplatte über einen akustischen Flüssigkeitshandler zu erkennen, wie gezeigt, was zu einer hochauflösenden Hefemalerei des Wissenschaftlers führte.
Verwenden Sie für diese Transformation frisch zubereitete Lösungen und DNA-Fragmente von hoher Qualität. Diese Methode kann auch für multiplexe Einführung von definierten Deletionen und Punktmutationen in die genomische DNA angewendet werden. Darüber hinaus können CRISPR-Regulierungsexperimente durchgeführt werden.
Diese Methode kann geändert werden, um mehr als freie crRNAs innerhalb eines Arrays einzuführen, um die Anzahl der gleichzeitigen Änderungen zu erhöhen, die vorgenommen werden können.
