Einer der vorgeschlagenen Mechanismen, mit denen therapeutische Anti-Tau-Antikörper die Pathologie bei der Alzheimer-Krankheit reduzieren, ist die Aufnahme der Clearance pathologischer aggregierter ehemaliger Tau durch Mikroglia. Hier stellen wir den Zellbasistest zur Beurteilung der Tau-Aufnahme durch Mikroglia vor. Dieser Test stellt ein nützliches Prüfwerkzeug dar, um den Wirkmechanismus von Anti-Tau-Antikörpern besser zu charakterisieren.
Am ersten Tag des Experiments bereiten Sie die BV-2-Zellen vor, indem Sie sie zuerst mit 1x PBS in dem Kolben waschen, in dem sie kultiviert wurden. Dann inkubieren Sie sie mit 05%trypsin EDTA bei 37 Grad Celsius und 5%C02, bis sie sich vom Kolben lösen. Setzen Sie die Zellen im Kulturmedium wieder auf, indem Sie drei- bis fünfmal nach oben und unten pfeifen.
Zählen Sie Zellen und bereiten Sie eine Zellsuspension mit einer Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter in Kulturmedium mit 200 Mikrogramm pro Milliliter Heparin vor. Fügen Sie 250 Mikroliter dieser Zellsuspension pro Brunnen in eine 96 Well-Gewebekultur-Flachbodenplatte. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5%C02, über Nacht.
Nach dem Auftauen zuvor vorbereiteter pH-Farbstoff-Tau-Aggregate auf Eis, verdünnen Sie sie in 65 Mikroliter pro Zustand des serumfreien Mediums, um eine 500 Nanomolar-Lösung zu bilden. Verdünnung von Antikörpern in 65 Mikroliter serumfreiem Medium, um die doppelte gewünschte Konzentration zu erreichen. Mischen Sie pH-Farbstoff-Tau-Aggregate und Antikörper in einer 96-Well-U-Bodenplatte.
Versiegeln Sie diese Verdünnungsplatte und brüten Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Tag das Medium von der 96-Wellplatte mit BV-2-Zellen entfernen. Waschen Sie die Zellen in jedem Brunnen mit 100 Mikroliter Raumtemperatur 1x PBS.
Entfernen Sie PBS von der BV-2-Zellplatte. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipetten, um 125 Mikroliter Aminokomplexe von der Verdünnungsplatte auf jeden Brunnen einer 96-Well-BV-2-Zellplatte zu übertragen und zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 zu brüten. Nach der Inkubation entfernen Sie die Aminokomplexe aus den Zellen und waschen Sie die Zellen in jedem Brunnen mit 100 Mikroliter Raumtemperatur 1x PBS.
Nach dem Entfernen der 1x PBS 50 Mikroliter 25%trypsin EDTA hinzufügen und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius mit 5% CO2 inkubieren. Danach fügen Sie 200 Mikroliter Kultivierungsmedium hinzu und hängen Sie den Brunnen wieder auf, indem Sie nach oben und unten pfeifen, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen auf eine 96 Well U-Bodenplatte und zentrifugieren Sie sie bei 400 x g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Legen Sie die Platte auf Eis, und entfernen Sie das Medium. 150 Mikroliter eiskalte 1x PBS und Zentrifuge wieder bei 400 g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius hinzufügen. Legen Sie die Platte auf Eis und waschen Sie wieder, indem Sie zuvor hinzugefügt 1x PBS entfernen und 150 Mikroliter eiskalte PBS pro Brunnen hinzufügen.
Zentrifuge wieder unter den gleichen Bedingungen. Legen Sie die Platte auf Eis und waschen Sie die Zellen, indem Sie die zuvor hinzugefügte PBS entfernen und 150 Mikroliter FACS Puffer pro Brunnen hinzufügen. Zentrifuge wieder bei 400 g für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.
Legen Sie die Platte auf Eis und entfernen Sie den zuvor hinzugefügten FACS-Puffer und setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter FACS-Puffer pro Brunnen wieder auf. Fahren Sie sofort mit der Analyse durch FACS fort, um 20.000 Ereignisse im Live-Zellentor zu erwerben. Verwenden Sie für die FACS-Analyse den Vorwärtsstreubereich oder FSCA im Vergleich zu seitenstreuungsflächen oder SSCA-Dichtediagramm, um auf lebenden Zellen zu torieren, indem Ereignisse mit niedrigeren Streuebenen nach vorne ausgeschlossen werden, z. B. Schutt und abgestorbene Zellen.
Verwenden Sie dann innerhalb der Lebendzellenpopulation FSCA versus Vorwärtsstreuhöhe oder FSCH, um ein Singlet-Gate zu erstellen und Zelldoublets und Aggregate auszuschließen. Verwenden Sie dann die Ereignisse im Singlet-Gate, um ein pH-Farbstoff-Einzelparameter-Histogramm zu generieren. Verwenden Sie das generierte Histogramm, um zunächst die mittlere Fluoreszenzintensität zu bestimmen.
Danach bestimmen Sie den Prozentsatz der pH-Farbstoff-Tau-positiven Zellen, indem Sie negative Zellen wie die einzige Kontrolle von USING BV-2 ausschließen. CBTau-28.1 Antikörper fördern eine Aufnahme von Tau in BV-2-Zellen in einer dosisabhängigen Weise, wie die Durchflusszytometrie zeigt. Der hochgradige doppelmutierte CBTau-28.1-Antikörper vermittelte die Tau-Aufnahme in den BV-2-Zellen in einem höheren Ausmaß als der Wildtyp-Antikörper.
CBTau-28.1 Fab-Fragmente haben die basale Tau-Aufnahme nicht erhöht, was auf einen FC-Rezeptor-vermittelten Internalisierungsmechanismus hindeutet. Konfokalmikroskopische bestätigte Antikörper-vermittelte Erhöhung der Tau-Aufnahme. Grüner pH-Farbstoff mit der Bezeichnung Tau-Aggregate, die oft mit Lysotracker-Rotfarbstoff enden, sauren Organellen, kolokalisiert, was auf das Vorhandensein von Tau-Aggregaten in einem endolysosomalen Fach hindeutet.
CBTau-28.1 Fab-Fragmente haben die Tau-Aufnahme nicht wieder erhöht, was darauf hindeutet, dass die Aufnahme tatsächlich FC vermittelt wurde. Der soeben beschriebene Test ermöglicht es uns, die von Tau vermittelte Antikörper gezielt durch Mikroglia zu quantifizieren. Daten, die mit diesem Test generiert werden, können helfen, den Wirkmechanismus von Anti-Tau-Antikörpern aufzuklären und somit ein nützliches Werkzeug zu sein, um Anti-Tau-Antikörper voranzutreiben, um ihre Entwicklung als potenzielle AD-Behandlung weiter voranzutreiben.
