Drosophila dient als gutes Modellsystem für das Studium der mitochondrialen Funktion. Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Gewebehomogenat von erwachsenen Fliegen vor. Dieses Protokoll erfordert keine Isolierung von Mitochondrien.
Es ist schnell und einfach und eignet sich zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Larven, kultivierten Zellen und Säugetiergeweben. Beginnen Sie mit dem Sammeln von erwachsenen Fliegen für jede Probe, stellen Sie sicher, mindestens dreifache Proben für jeden Genotyp zu sammeln. Bereiten Sie 500 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer mit 20 Millimolaren HEPES, einem Millimolaren EDTA und 0,1%triton X-100 in einem 1,5-Milliliter-Reagenzglas für jede Probe vor.
Anästhesisieren Sie die erwachsenen Fliegen mit Kohlendioxid auf einem Anästhesiepad. Um die Thoraxen zu isolieren, fixieren Sie sie mit einem Paar Zangen und isolieren Sie den Fliegenbauch, indem Sie entlang der Grenze des Thorax und Desdomen mit einer Schere schneiden. Sammeln Sie die Fliegenthoraxes für die Citrat-Synthase-Aktivität Assay.
10 erwachsene Fliegenthoraxes sofort auf 100 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer übertragen und mit einem Stößel auf Eis homogenisieren. Halten Sie die Proben kalt, indem Sie sie fünf bis zehn Sekunden auf Demeis homogenisieren, fünf Sekunden lang auf dem Eis sitzen lassen und sich dann wiederholen, bis alle Gewebe vollständig homogenisiert sind. Aliquot 10 Mikroliter jeder homogenisierten Probe in eine neue Röhre zur Messung des Proteingehalts, wodurch diese Tuben ebenfalls auf Eis gehalten werden.
Fügen Sie 400 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer zu jeder verbleibenden Probe für ein Gesamtvolumen von 500 Mikroliter und Pipette nach oben und unten sanft zu mischen. Für jede Reaktion einen Mikroliter verdünntes Zelllysat zu 150 Mikrolitern der frisch zubereiteten Reaktionslösung hinzufügen. Mischen Sie gründlich durch sanfte Pipettierung, um Blasenbildung zu vermeiden, dann verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption bei 412 Nanometern alle 10 bis 30 Sekunden für vier Minuten bei 25 Grad Celsius zu messen.
Zeichnen Sie die Daten im Laufe der Zeit als Absorptionskraft und berechnen Sie dann die Neigung für den linearen Teil der Kurve. Dividieren Sie schließlich die Reaktionsgeschwindigkeit oder Steigung durch die Probenproteinkonzentration, um die Citratsynthase-Aktivität zu normalisieren. Es wurde vermutet, dass Knockdown von dRNF34 in Drosophila Muskel würde mitochondriale Citrat-Synthase-Aktivität zu erhöhen, während Knockdown von dPGC-1 würde diese Erhöhung umkehren.
Für jeden Test wurde eine erste lineare enzymatische Rate festgelegt; die Steigungen der Trendlinien stellen die maximalen Reaktionsraten dar, die den maximalen Citrat-Synthase-Aktivitäten der verschiedenen Genotypen entsprechen. Die maximalen Citrat-Synthase-Aktivitäten wurden aus den kinetischen Kurven berechnet und durch die Proteinkonzentration normalisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Synthase-Aktivität von Fliegenthoraxen tatsächlich mit muskelspezifischem dRNF34 Knockdown zunahm und die Erhöhung durch muskelspezifischen dPGC-1-Knockdown umgekehrt wurde.
Bei der Homogenisierung der Probe ist es wichtig, das Rohr zu kippen und das Homogenat zu überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Gerinnsel vorhanden sind und die Gewebe im Rohr vollständig homogenisiert sind. Nach der Probenentnahme sollten alle Probenbehandlungen auf Eis durchgeführt werden. Der Citrat-Synthase-Aktivitätstest wird verwendet, um intakte mitochondriale Masse zu quantifizieren.
Die richtige Quantifizierung der intakten mitochondrialen Masse ist sehr wichtig für die Bewertung der mitochondrialen Funktion.
