Wir haben bereits ein Gerät entwickelt, um mechanische Dehnungaufhalten auf haftende Zellen anzuwenden. In der aktuellen Arbeit haben wir die Geometrie des Substratums neu gestaltet und das Setup für die hochauflösende Bildgebung dieser Stammzellen angepasst. Der Hauptvorteil dieses Zell-Stretching-Systems ist, dass es eine hochauflösende subzelluläre Bildgebung bei 100-fachen der Stammzellen bietet.
Die Substratum-Fertigung demonstriert Vicki, eine wissenschaftliche Mitarbeiterin aus meinem Labor. Beginnen Sie mit dem Entwerfen einer Single-Well-Polydimethylsiloxan-Form, indem Sie dem begleitenden Textprotokoll folgen. Als nächstes mischen Sie 20 Teile einer Polydimethylsiloxan-Basis mit einem Teilhärtungsmittel in einem Einwegbecher.
Nach dem Mischen die Polydimethylsiloxan-Mischung in einen Vakuum-Engasser bei 0,8 bar für 30 Minuten legen, um die Blasen aus der Mischung zu entfernen. Dann gießen Sie die Polydimethylsiloxan-Mischung in die Form und die Schale. Entfernen Sie in dieser Phase alle zusätzlichen Blasen, indem Sie sie 30 Minuten lang bei 0,8 bar Vakuum wieder entgasen.
Wenn die Entgasung abgeschlossen ist, backen Sie die Proben bei 80 Grad Celsius auf einem Nivellierungstisch für zwei Stunden. Als nächstes entfernen Sie die Proben vorsichtig aus dem Ofen und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie die Kanten mit einer Klinge und schälen Sie das ausgehärtete Polydimethylsiloxan vorsichtig heraus.
Zeichnen Sie auf dem Polydimethylsiloxan mit einem Durchmesser von 150 Millimetern ein zwei Zentimeter mal zwei Zentimeter großes Gitter mit einem Marker. Zeichnen Sie innerhalb jedes Quadrats einen Zentimeter mal einen Zentimeter Quadrat, so dass auf allen Seiten ein Rand von 0,5 Zentimetern übrig bleibt. Verwenden Sie eine Klinge, um sorgfältig entlang der Linien zu schneiden und quadratische Fächer zu erhalten.
Als nächstes reinigen Sie die Proben, indem Sie sie vier Stunden lang in 100% Aceton, für weitere vier Stunden 100% Ethanol und dann vier Stunden lang in autoklaviertem Wasser gießen. Legen Sie die gereinigten Proben auf Paraffinfolienunterlagepapier in eine Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 150 Millimetern und trocknen Sie die Probe vier Stunden lang in einem 80-Grad-Celsius-Ofen. Wenn Sie fertig sind, versiegeln Sie die Gerichte mit Paraffinfolie und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung in einem Kühlraum.
Bereiten Sie Vorläuferzellen vor und suspendieren Sie sie im Proliferationsmedium. Säen Sie diese Zellen mit einer Dichte von 35.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf PDL-beschichtete Kunststoffoberflächen. Passen Sie das Volumen des Proliferationsmediums auf drei Milliliter pro zehn Zentimeter Quadratfläche an.
Ein geringeres Medienvolumen kann zu Zellverklumpung führen, die durch Oberflächenspannungskräfte entsteht, während ein höheres Medienvolumen in den Schalen dazu führen kann, dass die Medien überschwappen. Am dritten Tag nach der Aussaat die Zellen ernten und mit einem Hämozytometer zählen. Dann Samen 35 000 Zellen pro Polydimethylsiloxan-Platte mit 700 Mikroliter Proliferationsmedium.
Als Nächstes fügen Sie ein Plasmisches Konstrukt hinzu, um die Histon-H2B-Komplexe der Zelle mit grünem fluoreszierendem Protein zu beschriften, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen. Montieren Sie nach 24 Stunden die Polydimethylsiloxan-Proben mit Zellen, die auf der uniaxialen Dehnungsvorrichtung gedehnt werden sollen. Ändern Sie dann das Medium in allen Proben in Differenzierungsmedium.
Messen Sie die untrainierte Zellkompartimentlänge und drehen Sie die Bühnenmikrometerschraube, um die Zellfachlänge um die gewünschte Dehnung zu erhöhen. Lassen Sie die gestreckten und ungestreckten Polydimethylsiloxan-Proben im Inkubator bei 37 Grad Celsius bis zur Bildgebung. Bereiten Sie den Mikroskop-Inkubator für die Live-Bildgebung vor, indem Sie die Inkubatortemperatur auf 37 Grad Celsius einstellen.
Als nächstes bringen Sie ein 100-faches Öl-Immersionsziel in die zentrale Position, da die objektive Drehung später nicht mehr zugänglich sein wird. Sobald sie in Position sind, schrauben Sie das Objektiv ab und schrauben Es mit einem Objektivring wieder zusammen, damit das Ziel näher an die Zellen gebracht werden kann. Fügen Sie dann einen Tropfen Öl zum Ziel hinzu.
Mit einem kundenspezifisch bedruckten Halter den Halter mit Vakuumfett am Rand des Fensters beschichten und eine Nummer Null Dicke Glasabdeckung auf die Oberseite des Halters legen. Kleben Sie das Kunststofffenster auf die Mikroskopbühne. Als nächstes schrauben Sie eine Z-Übersetzungsstufe auf die Mikroskopstufe und bewegen Sie sie in die oberste Z-Position.
Entfernen Sie 500 Mikroliter des Mediums von der zu bebilderten gestreckten Polydimethylsiloxanplatte, und fügen Sie dieses Medium auf den Glasdeckel im weißen Kunststofffenster ein. Verwenden Sie dann eine sterile Pinzette, um das quadratische Fach vorsichtig von der Polydimethylsiloxan-Platte zu lösen. Halten Sie die Dehnungsvorrichtung in einer aufrechten Position, so dass die Zellen nach oben, über dem weißen Kunststofffenster und vorsichtig invertieren sie die Dehnungsvorrichtung, so dass jedes zusätzliche Medium direkt in der Mitte der Glasabdeckung mit nach unten gerichteten Zellen abfallen kann.
Legen Sie den unteren Teil des Zuggeräts mit doppelseitigem Klebeband auf die Z-Übersetzungsstufe, um ihn an Ort und Stelle zu halten. Beim Blick durch das Okular unter hellem Feld, sehr langsam bringen Sie das Dehnungsgerät nach unten und bewegen Sie das Ziel nach oben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren. Führen Sie diesen Fokussierungsschritt langsam durch, indem Sie zwischen dem Absenken der Z-Übersetzungsstufe und der Erhöhung des Ziels wechseln.
Wenn die Z-Übersetzungsstufe zu stark absinkt, könnten die Zellen komprimieren und damit absterben. Wenn wir das Ziel zu hoch anheben, könnte es den Glasdeckel brechen und das Medium auslaufen lassen. Scannen Sie die Polydimethylsiloxan-Platte in X- und Y-Richtung, um eine Zelle zu finden, die einen fluoreszierenden Kern hat, mit Epifloreszenz bei 488 Nanometern Anregung.
Stellen Sie außerdem sicher, dass die Zelle über eine geeignete Morphologie verfügt, wenn Sie die Probe unter hellem Feld betrachten. Zeichnen Sie Weitfeld- oder Offenelochbilder des Kerns mit 488 Nanometern Wellenlängenanregung und der Zelle mit Hellfeldanregung in 30-Sekunden-Intervallen pro Frame für eine Gesamtdauer von mindestens 30 Minuten auf. Die neu gestaltete Geometrie des Polydimethylsiloxan-Substrats und das in diesem Video gezeigte Bildgebungs-Setup minimiert den Abstand zwischen den Zellen und dem Objektiv.
Dies ermöglicht eine Zeitraffer-Bildgebung von fluoreszierend markierten Zellkernen mit einem 100-fachen Öl-Immersion-Objektiv. Um die nuklearen Schwankungen zu messen, planen Sie zuerst das Kerngebiet im Vergleich zur Zeit. Dann detrendieren Sie die Daten mit einem Polynom dritter Ordnung.
Und schließlich, diagramm Restschwankungen und berechnen Standardabweichung der Restschwankungen. Die nuklearen Schwankungen der Oligodendrozytor-Vorläuferzellen nach chemischer Induktion der Differenzierung mit und ohne 10%Zugstamm zeigen, dass bei chemischer Induktion allein die Amplitude von Kernschwankungen bei 48 Stunden, aber nicht bei 24 Stunden signifikant abnahm. Auf der anderen Seite zeigte die chemische Induktion zusammen mit einem 10%stensiven Stamm einen signifikanten Rückgang nach 24 Stunden, der ohne weitere Reduktion bei 48 Stunden konstant blieb.
Das Wichtigste, was man sich merken sollte, ist, dass der Arbeitsabstand des gewählten Ziels gleich oder größer sein sollte als die Tiefe des Zellfachs plus die Dicke des Deckels. Das Substratum kann neu gestaltet werden, um ein Raster zu integrieren, das die Bildgebung derselben Zelle vor und nach der Anwendung des Stammes erleichtern würde, da ein Vorher-Nachher-Dataset-Typ das Rauschen reduziert, das durch experimentelle Fehler entsteht. Mit diesem bildgebenden Setup können viele subzelluläre Phänomene innerhalb anhaftender Lebendzellen, wie die Proteinlokalisierung oder die Dynamik zellulärer Komponenten, innerhalb von Sekunden nach der Anwendung der mechanischen Dehnung abbilden.
