In precedenza abbiamo progettato un dispositivo per applicare la deformazione meccanica alle celle aderenti. Nel lavoro attuale, abbiamo ridisegnato la geometria del substrato e personalizzato la configurazione per l'imaging ad alta risoluzione di queste cellule di deformazione. Il vantaggio principale di questo sistema di allungamento cellulare è che fornisce un imaging subcellulare ad alta risoluzione a 100 volte le cellule di deformazione.
A dimostrare la fabbricazione del substrato sarà Vicki, un assistente di ricerca del mio laboratorio. Inizia progettando uno stampo in polidimetilsiloxano a pozzo singolo seguendo il protocollo di testo di accompagnamento. Quindi, mescolare 20 parti di una base di polidimetilsilossano con un agente polimerizzante di una parte in una tazza monouso.
Una volta miscelato, posizionare la miscela di polidimetilsilossano in un de-gassatore sottovuoto a 0,8 bar per 30 minuti per rimuovere le bolle dalla miscela. Quindi, versare il mix di polidimetilossano nello stampo e nel piatto. Rimuovere eventuali bolle aggiuntive in questa fase de-gaszzando di nuovo a 0,8 bar di vuoto per 30 minuti.
Al termine della de-gassificazione, cuocere i campioni a 80 gradi Celsius su un tavolo di livellamento per due ore. Quindi, rimuovere con cura i campioni dal forno e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente. Tagliare i bordi con una lama e sbucciare delicatamente il polidimetilsiloxano stagionato.
Sulla griglia di 150 millimetri di diametro polidimetilossano, disegnare una griglia di due centimetri per due centimetri con un marcatore. All'interno di ogni quadrato, disegnare un centimetro per un centimetro quadrato, lasciando un margine di 0,5 centimetri su tutti i lati. Utilizzare una lama per tagliare con cura lungo le linee e ottenere scomparti quadrati.
Quindi, pulire i campioni incubandoli in acetone al 100% per quattro ore, 100% etanolo per altre quattro ore e quindi in acqua autoclavata per quattro ore. Posizionare i campioni puliti sulla carta di supporto del film di paraffina all'interno di un piatto di plastica di 150 millimetri di diametro e asciugare il campione in un forno a 80 gradi Celsius per quattro ore. Al termine, sigillare i piatti con pellicola di paraffina e conservarli in una stanza fredda fino a un ulteriore utilizzo.
Preparare le cellule progenitrici e sospenderle nel mezzo di proliferazione. Semina queste cellule ad una densità di 35.000 cellule per centimetro quadrato su superfici plastiche rivestite di PDL. Regolare il volume del mezzo di proliferazione a tre millilitri per dieci centimetri quadrati di superficie.
Un volume inferiore di mezzi può portare al raggruppamento cellulare, derivante da forze di tensione superficiale, mentre un volume più elevato di mezzi nei piatti può causare la fuoriuscita del supporto. Il terzo giorno dopo la semina, raccogliere le cellule e contarle usando un emocitometro. Quindi, seminare 35.000 cellule per piastra di polidimetilsilossano con 700 microlitri di mezzo di proliferazione.
Successivamente, aggiungi un costrutto plasmatico per etichettare i complessi H2B istono della cellula con proteine fluorescenti verdi seguendo le istruzioni del produttore. Dopo 24 ore, montare i campioni di polidimetilsilossano con cellule da allungare sul dispositivo di deformazione uniassiale. Quindi, cambiare il mezzo in tutti i campioni in mezzo di differenziazione.
Misurare la lunghezza del compartimento cellulare non teso e ruotare la vite del micrometro dello stadio per aumentare la lunghezza del compartimento cellulare della quantità di deformazione desiderata. Lasciare i campioni di polidimetilossano di polidimetilsilano allungati e non allungati nell'incubatrice a 37 gradi Celsius fino all'imaging. Preparare l'incubatore di microscopi per l'imaging dal vivo impostando la temperatura dell'incubatore a 37 gradi Celsius.
Successivamente, porta un obiettivo di immersione dell'olio 100x nella posizione centrale, poiché la svolta oggettiva non sarà accessibile in seguito. Una volta in posizione, svitare l'obiettivo e avvitarlo insieme a un anello obiettivo, in modo che l'obiettivo possa essere avvicinato alle celle. Quindi, aggiungi una goccia di olio all'obiettivo.
Utilizzando un supporto stampato su misura, rivestire il supporto con grasso sottovuoto alla periferia della finestra e posizionare un copriscivolo in vetro a spessore zero sulla superficie superiore del supporto. Nastro la finestra di plastica sul palco del microscopio. Successivamente, avvitare una fase di traslazione Z sullo stadio del microscopio e spostarla nella posizione Z più in alto.
Rimuovere 500 microlitri del mezzo dalla piastra di polidimetilsiloxane allungata da imaged, e aggiungere questo mezzo sul coverslip di vetro nella finestra di plastica bianca. Quindi, utilizzare un paio di pinzette sterili per staccare con cura il compartimento quadrato dalla piastra di polidimetilsiloxano. Tenere il dispositivo di deformazione in posizione verticale in modo che le celle siano rivolte verso l'alto, sopra la finestra di plastica bianca e invertire attentamente il dispositivo di deformazione, in modo da lasciare cadere qualsiasi mezzo extra direttamente al centro del coperchio di vetro con le celle rivolte verso il basso.
Posizionare la parte inferiore del dispositivo di deformazione sullo stadio di traslazione Z utilizzando nastro a doppia mano per tenerlo in posizione. Mentre guardi attraverso l'oculare sotto un campo luminoso, porta molto lentamente il dispositivo di deformazione verso il basso e sposta l'obiettivo verso l'alto per concentrarti sulle cellule. Eseguire lentamente questo passaggio di messa a fuoco, alternando l'abbassamento della fase di traduzione Z e l'innalzamento dell'obiettivo.
Se la fase di traslazione Z si abbassa troppo, le celle potrebbero comprimere e quindi morire. Se alziamo l'obiettivo troppo in alto, potrebbe rompere il coperchio del vetro e causare la perdita del mezzo. Scansionare la piastra polidimetilossano in direzioni X e Y per trovare una cellula che abbia un nucleo fluorescente, usando l'epiflorescenza a 488 nanometri di eccitazione.
Assicurarsi inoltre che la cellula abbia una morfologia appropriata quando si guarda il campione sotto un campo luminoso. Registrare immagini a campo largo o a foro aperto del nucleo con 488 nanometri di eccitazione della lunghezza d'onda e della cellula con eccitazione a campo luminoso a intervalli di 30 secondi per fotogramma per una durata totale di almeno 30 minuti. La geometria ridisegnata del substrato di polidimetilossano e la configurazione di imaging mostrata in questo video riducono al minimo la distanza tra le cellule e l'obiettivo.
Ciò consente l'imaging time-lapse di nuclei cellulari etichettati fluorescentmente utilizzando un obiettivo di immersione dell'olio 100x. Per misurare le fluttuazioni nucleari, tracciare prima l'area nucleare rispetto al tempo. Quindi, detrend i dati utilizzando un polinomio di terzo ordine.
Infine, tracciare le fluttuazioni residue e calcolare la deviazione standard delle fluttuazioni residue. Le fluttuazioni nucleari delle cellule progenitrici degli oligodendrociti, a seguito dell'induzione chimica della differenziazione con e senza un ceppo di trazione del 10%, mostrano che con la sola induzione chimica, l'ampiezza delle fluttuazioni nucleari ha mostrato una diminuzione significativa a 48 ore, ma non a 24 ore. D'altra parte, l'induzione chimica e una tensione di trazione del 10% hanno mostrato una diminuzione significativa a 24 ore, che è rimasta costante senza ulteriori riduzioni a 48 ore.
La cosa più importante da ricordare è che la distanza di lavoro dell'obiettivo scelto dovrebbe essere uguale o maggiore della profondità del compartimento cellulare più lo spessore del coverslip. Il substrato può essere riprogettato per incorporare una griglia, che faciliterebbe l'imaging della stessa cella prima e dopo l'applicazione dello sforzo, poiché un tipo di set di dati prima e dopo riduce il rumore proveniente da errori sperimentali. Utilizzando questa configurazione di imaging, molti fenomeni subcellulari all'interno di cellule vive aderenti, come la localizzazione proteica o la dinamica dei componenti cellulari, possono essere immagini in pochi secondi dall'applicazione del ceppo meccanico.
