我々は以前に付着細胞に機械的なひずみを適用する装置を設計した。現在の作業では、下層部の形状を再設計し、これらの歪みセルの高解像度イメージング用の設定をカスタマイズしました。この細胞伸張システムの主な利点は、100xの株細胞での高解像度の細胞下イメージングを提供することです。
私の研究室の研究アシスタントであるヴィッキーは、皮下製作のデモンストレーションを行います。付属のテキストプロトコルに従って、単一ウェルポリジメチルシロキサン型を設計することで始めます。次に、ポリジメチルシロキサンベースの20部を、使い捨てカップに1部硬化剤と混合します。
混合したら、ポリジメチルシロキサンミックスを0.8バールの真空脱ガッサーに30分間置き、混合物から気泡を取り除きます。次に、ポリジメチルシロキサンミックスをカビと皿に注ぎます。この段階で、0.8バー真空で30分間再びガスを脱ガスすることによって、追加の気泡を取り除きます。
脱ガスが完了したら、レベリングテーブルで80°Cでサンプルを2時間焼きます。次に、慎重にオーブンからサンプルを取り出し、室温まで冷却させます。刃で縁を切り、硬化したポリジメチルシロキサンを静かに剥がします。
直径150ミリメートルのポリジメチルシロキサンに、マーカーを持つ2センチメートルのグリッドを2センチメートル引きます。各正方形内では、1センチメートル×1センチメートルの正方形を描き、すべての側面に0.5センチメートルのマージンを残します。ブレードを使用してラインに沿って慎重に切断し、正方形のコンパートメントを取得します。
次に、サンプルを100%アセトンで4時間、100%エタノールでさらに4時間インキュベートし、次に4時間オートクレーブ水で洗浄します。洗浄したサンプルをパラフィンフィルムバッキングペーパーの直径150ミリメートルのプラスチック皿の中に入れ、サンプルを80°Cのオーブンで4時間乾燥させます。完成したら、パラフィンフィルムで封じ、さらに使用するまで冷たい部屋に保管してください。
前駆細胞を調製し、増殖培地でそれらを中断します。これらの細胞をPDLコーティングされたプラスチック表面に1平方センチメートルあたり35,000個の細胞の密度で播種します。拡散媒体の体積を表面積の10センチメートル平方メートルあたり3ミリリットルに調整します。
メディアの量が少なくなると、表面張力に起因する細胞の凝集につながる可能性がありますが、皿の中のメディアの量が多いとメディアがこぼれる可能性があります。播種後3日目に、細胞を収穫し、ヘモサイトメーターを使用して数えます。次いで、700マイクロリットルの増殖培地を有するポリジメチルシロキサンプレート当たり35,000個の細胞をシードする。
次に、メーカーの指示に従って、細胞のヒストンH2B複合体を緑色蛍光タンパク質で標識するためのプラスミックコンストラクトを追加します。24時間後、ポリジメチルシロキサンサンプルを、単軸歪み装置上に伸ばされる細胞と一緒に取り付ける。次に、すべてのサンプル中の培地を分化培地に変更します。
不訓練セルコンパートメントの長さを測定し、ステージマイクロメータのネジを回して、所望の歪み量だけセルコンパートメントの長さを増やします。伸ばした伸ばした伸ばしていないポリジメチルシロキサンサンプルを、イメージングまで37°Cのインキュベーターに残します。インキュベーター温度を摂氏37度に設定して、ライブイメージング用の顕微鏡インキュベーターを準備します。
次に、目標ターンイットは後でアクセスできなくなるので、100x油浸漬目標を中央の位置に持ち込みます。位置に入ったら、目的を緩めて、客観的なリングと一緒にねじ込んで、目的を細胞に近づけることができます。その後、目的に油を一滴追加します。
カスタムプリントホルダーを使用して、窓の周囲に真空グリースでホルダーをコーティングし、ホルダーの上面に厚さ0のガラスカバースリップを置きます。プラスチック製の窓を顕微鏡のステージにテープで貼ります。次に、Z変換ステージを顕微鏡ステージにねじ込み、最上のZ位置に移動します。
画像化する伸ばしたポリジメチルシロキサンプレートから培地の500マイクロリットルを取り除き、白いプラスチック窓のガラスカバースリップにこの培地を加えます。次に、滅菌用ピンセットを使用して、ポリジメチルシロキサンプレートから正方形のコンパートメントを慎重に取り外します。細胞が白いプラスチック窓の上に向くように歪み装置を直立した位置に保持し、慎重に歪み装置を反転させて、余分な媒体がガラスカバースリップの真ん中に直接落とすようにして、細胞を下に向けます。
歪み装置の底部を、両面テープを使用してZ変換段階に置き、所定の位置に保持します。明るいフィールドの下で接眼レンズを見ながら、非常にゆっくりと歪み装置を下に持って来て、細胞に焦点を合わせるために目標を上に移動します。Z変換段階の低下と目標の引き上げの間で交互に、この焦点合わせステップをゆっくりと実行します。
Z変換段階が低下しすぎると、細胞が圧縮され、死ぬ可能性があります。目標を高くしすぎると、ガラスのカバースリップが壊れ、媒体が漏れる可能性があります。XおよびY方向のポリジメチルシロキサンプレートをスキャンして、488ナノメートルの励起でエピフロリセンスを使用して、蛍光核を有する細胞を見つける。
また、明視野下のサンプルを見るとき、細胞が適切な形態を持っていることを確認してください。488ナノメートルの波長励起を有する核の広視野または開いたピンホール画像を、フレームあたり30秒間隔で、少なくとも30分間の明視野励起を有する細胞の画像を記録する。ポリジメチルシロキサンのサブストラタムの再設計された幾何学と、このビデオに示すイメージング設定は、細胞と目的との間の距離を最小限に抑えます。
これにより、100x油浸出目的を用いて蛍光標識された細胞核のタイムラプスイメージングが可能になります。核変動を測定するには、まず核面積対時間をプロットする。次に、3 次多項式を使用してデータのトレンドを解除します。
最後に、残差変動をプロットし、残差変動の標準偏差を計算します。オリゴデンドロシテ前駆細胞の核変動は、10%引張歪みの有無にかかわらず分化の化学的誘導に続いて、化学的誘導単独で、核変動の振幅が48時間で有意な減少を示したが、24時間では示さなかったことを示している。一方、10%引張歪みと共に化学誘導は24時間で有意な減少を示し、48時間で更に減少することなく一定の状態を保った。
覚えておくべき最も重要なことは、選択された目的の作業距離は、セルコンパートメントの深さとカバースリップの厚さを加えたもの以上でなければならないということです。データセットの前後のタイプは実験エラーからのノイズを低減するので、このサブストラタムはグリッドを組み込んで、歪みの適用前後に同じセルをイメージングしやすくするように再設計することができます。このイメージング設定を用いて、接着生細胞内の多くの細胞内現象、例えばタンパク質の局在化または細胞成分のダイナミクスなど、機械的歪みを適用した数秒以内に画像化することができる。
