우리는 이전에 부착 셀에 기계적 변형을 적용하는 장치를 설계했습니다. 현재 작업에서, 우리는 하위 층의 형상을 재 설계하고 이러한 변형 세포의 고해상도 이미징을위한 설정을 사용자 정의했다. 이 세포 스트레칭 시스템의 주요 장점은 스트레인 세포의 100x에서 고해상도 세포 전도 영상을 제공한다는 것입니다.
하위 지제작을 시연하는 것은 내 실험실의 연구 조수 인 비키가 될 것입니다. 먼저 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 단일 웰 폴리디메틸실록산 몰드를 디자인합니다. 다음으로 폴리디메틸실록산 베이스의 20개 부분을 일회용 컵에 하나의 부품 경화제와 혼합합니다.
혼합되면 폴리디메틸실록산 믹스를 진공 드 가스솔에 0.8 bar에 30분간 놓아 거품을 섞어 제거합니다. 그런 다음 폴리디메틸실록산 믹스를 금형과 접시에 붓습니다. 이 단계에서 0.8 bar 진공 상태에서 30분 동안 다시 가스를 제거하여 추가 거품을 제거합니다.
탈가스가 완료되면 수평 테이블에 섭씨 80도에서 샘플을 2시간 동안 굽습니다. 다음으로, 조심스럽게 오븐에서 샘플을 제거하고 실온으로 냉각할 수 있습니다. 블레이드로 가장자리를 자르고 경화 된 폴리디메틸실록산을 부드럽게 벗깁니다.
직경 150mm의 폴리디메틸실록산에서 마커로 2센티미터 그리드를 그립니다. 각 사각형 내에서 1센티미터를 1센티미터 로 끌어올아 모든 면에서 0.5cm의 마진을 남깁니다. 블레이드를 사용하여 라인을 따라 조심스럽게 자르고 사각형 구획을 얻습니다.
다음으로, 4시간 동안 100% 아세톤, 100% 에탄올을 4시간 동안 배양한 다음 4시간 동안 오토클레이브 워터로 샘플을 청소합니다. 청소된 샘플을 150mm 직경의 플라스틱 접시 안에 파라핀 필름 백킹 페이퍼에 놓고 샘플을 섭씨 80도 오븐에서 4시간 동안 건조시로 만듭니다. 완료되면 파라핀 필름으로 요리를 밀봉하고 추가 사용이 있을 때까지 차가운 방에 보관하십시오.
전구 세포를 준비하고 증식 배지에서 중단하십시오. 이 세포를 35, 평방 센티미터당 000 개의 세포로 PDL 코팅 플라스틱 표면에 시드하십시오. 증식 배지의 부피를 표면적 의 10센티미터 제곱당 3밀리리터로 조정합니다.
매체의 양이 적을수록 표면 장력력으로 인해 세포 가동이 발생할 수 있으며, 접시에 있는 미디어의 양이 많을수록 미디어가 유출될 수 있습니다. 파종 후 셋째 날에는 세포를 수확하고 혈류계를 사용하여 계산합니다. 이어서, 종자 35, 000 세포당 폴리디메틸실록산 플레이트당 700 마이크로리터의 증식 배지.
다음으로 제조업체의 지시에 따라 세포의 히스톤 H2B 복합체에 녹색 형광 단백질을 라벨링하는 플라스믹 구조를 추가합니다. 24시간 후, 단산소 균주 장치에 뻗어질 세포를 가진 폴리디메틸실록산 샘플을 장착한다. 그런 다음 모든 샘플에서 배지를 분화 매체로 변경합니다.
훈련되지 않은 셀 컴파트먼트 길이를 측정하고 스테이지 마이크로미터 나사를 돌려 원하는 양의 균주에 의해 셀 컴파트먼트 길이를 늘립니다. 화상 진찰까지 37섭씨에서 인큐베이터에 뻗어 있고 뻗지 않은 폴리디메틸실록산 샘플을 둡니다. 인큐베이터 온도를 섭씨 37도로 설정하여 라이브 이미징을 위한 현미경 인큐베이터를 준비합니다.
다음으로, 목표 턴릿에 접근할 수 없기 때문에 100배 오일 침지 목표를 중앙 위치에 가져옵니다. 일단 위치에 있으면 목표를 풀고 객관적인 링과 함께 다시 나사를 짜서 목표를 세포에 더 가까이 가져올 수 있습니다. 그런 다음 목표에 오일 한 방울을 추가합니다.
맞춤형 인쇄 홀더를 사용하여 창 주변에 진공 그리스로 홀더를 코팅하고 홀더의 상단 표면에 숫자 0 두께 유리 커버슬립을 놓습니다. 플라스틱 창을 현미경 단계에 테이프로 테이프로 두습니다. 다음으로, Z 번역 스테이지를 현미경 스테이지에 나사로 배치하고 가장 많은 Z 위치로 이동합니다.
이미지화할 확장된 폴리디메틸실록산 플레이트에서 배지 500마이크로리터를 제거하고 흰색 플라스틱 창의 유리 커버슬립에 이 매체를 추가합니다. 그런 다음 멸균 핀셋 한 쌍을 사용하여 폴리디메틸실록산 플레이트에서 사각형 구획을 조심스럽게 분리합니다. 스트레인 장치를 똑바로 세워 서 세포가 위쪽을 향하고 있고, 흰색 플라스틱 창 위에 조심스럽게 변형 장치를 반전시키도록 하여, 세포가 아래로 향하는 유리 커버슬립의 중간에 직접 떨어뜨리도록 한다.
스트레인 장치의 하단 부분을 양면 테이프를 사용하여 Z 번역 단계에 배치하여 제자리에 고정합니다. 밝은 필드 아래 접피스를 통해 보는 동안, 매우 천천히 변형 장치를 아래로 가져와 세포에 초점을 목표를 이동합니다. Z 번역 단계의 하강과 목표 의 제기 사이에 번갈아 이 초점 단계를 천천히 수행합니다.
Z 번역 단계가 너무 많이 낮아지면 세포가 압축되어 죽을 수 있습니다. 목표를 너무 높게 올리면 유리 커버슬립을 깨고 매체가 누출될 수 있습니다. 488 나노미터 흥분에서 에필플로클레스엔션을 사용하여 형광 핵을 가지고 있는 세포를 찾기 위해 X 및 Y 방향으로 폴리디메틸실록산 플레이트를 스캔한다.
또한 밝은 필드 아래 샘플을 볼 때 세포에 적절한 형태가 있는지 확인하십시오. 488나노미터의 파장 여기를 가진 핵의 광시야 또는 개방핀홀 이미지를 기록하고, 프레임당 30초 간격으로 30초 간격으로 밝은 필드 흥분을 가진 세포의 총 지속 시간 30분. 폴리디메틸실록산 의 형상과 이 비디오에 표시된 이미징 설정은 세포와 목표 사이의 거리를 최소화합니다.
이를 통해 100x 오일 침지 목표를 사용하여 형광으로 표지된 세포 핵의 시간 경과 이미징을 가능하게 합니다. 핵 변동을 측정하려면 먼저 핵 지역을 시간 대비 플롯합니다. 그런 다음, 제 3 차 다항형을 사용하여 데이터를 해독한다.
그리고 마지막으로 잔류 변동을 플롯하고 잔류 변동의 표준 편차를 계산합니다. 올리고덴드로시테 전구세포의 핵 변동은 10%인장 균주 유무에 관계없이 분화의 화학적 유도에 따라 화학적 인장균만으로는 48시간 만에 핵 변동이 크게 감소한 것으로 나타났지만 24시간은 아닌 24시간 동안은 그렇지 않다. 한편, 화학유도는 10%인장 균주와 함께 24시간 에서 현저한 감소를 보였으며, 이는 48시간 에서 추가 감소 없이 일정하게 유지되었습니다.
기억해야 할 가장 중요한 것은 선택한 목표의 작업 거리가 셀 컴파트먼트의 깊이와 커버슬립의 두께보다 같거나 클 수 있다는 것입니다. 데이터 세트의 전후 유형이 실험 오류로 인한 소음을 감소시키기 때문에 하위 계층은 변형을 적용하기 전과 후에 동일한 셀을 이미징할 수 있는 그리드를 통합하도록 재설계될 수 있습니다. 이 이미징 설정을 사용하여, 세포 성분의 단백질 국소화 또는 역학과 같은 부착 된 살아있는 세포 내의 많은 세포 전현상은 기계적 변형을 적용 한 몇 초 이내에 이미지화 될 수 있습니다.
