Wir untersuchten die Verfügbarkeit der Löslichkeit von Mikrometallen wie Zinkselen mit verschiedenen chemischen Formen oder Quellen, wie wir es nennen, im Zusammenhang mit der Veränderung der Futterzusammensetzung. In einer Radionuklidsuite etwa 0,2 Gramm gemahlene atlantische Lachsfutterproben wiegen und mit einem Zinkradiotracer mit bekannter spezifischer Aktivität in einem Probenröhrchen mit fünf Milliliter Volumen mischen. Bereiten Sie sechs weitere Aliquoten des Puffers vor und fügen Sie jeweils eine der hier gezeigten Aminosäuren hinzu, um eine endgültige molare Konzentration von fünf Millimolaren zu erreichen.
Fügen Sie Süßwasser-Darm-Luminalpuffer hinzu, um die Probe zu füttern. Als nächstes fügen Sie den Süßwasser-Darm-Luminalpuffer zu den Puffer-Aliquoten hinzu, die die Aminosäuren enthalten. Schließen Sie die Rohre und drehen Sie sie auf einem Drehspinner bei 25 U / min für 30 Minuten.
Dann zentrifugieren Sie bei 1.157 x g für 10 Minuten, um die löslichen und nicht löslichen Fraktionen zu trennen. Verwenden Sie einen Gamma-Kassierer, um die Anzahl pro Minute des Zink-Radiotracers in den löslichen und unlöslichen Fraktionen zu messen. Waschen Sie die aus Regenbogenforellen gewonnene Darmzelllinie zweimal mit einem Milliliter EDTA-Lösung und saugen Sie die Lösung nach jeder Wäsche mit einer Pipette ab.
Behandeln Sie die gewaschenen Zellen mit 0,25% Trypsinlösung. Drehen Sie den Kolben zwei Minuten lang vorsichtig in spitzen Winkeln. Fügen Sie dann 10 Milliliter L-15-Medium mit 5% FBS hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren.
Dekantieren Sie die resultierende Zellsuspension mit einer sterilen Pipette in ein konisches Bodenzentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 130 x G für drei Minuten. Bestimmen Sie dann mit einem Hämozytometer die Dichte der geernteten Zellen durch manuelles Zählen.
Säen Sie die Zellen auf 24 Well-Platten mit einer Zelldichte von 50.000 Zellen pro Milliliter pro Well und inkubieren Sie die Platten bei 19 Grad Celsius unter normaler Atmosphäre für 48 Stunden vor den Experimenten. Nachdem Sie die Fische 11 Tage lang gefüttert und eingeschläfert haben, sammeln Sie eine gepoolte Probe des Fischkots, indem Sie sich von der Bauchflosse zum Anus entfernen und auf einen Teller legen. Verwenden Sie einen Spatel, um den Kot von der Platte in ein 50 Milliliter konisches Rohr zu übertragen.
Lagern Sie die Proben sofort bei 20 Grad Celsius. In dieser Studie wird die mineralische Verfügbarkeit von Fischfutter mit einer Reihe von komplementären Methoden bewertet. Die repräsentative Analyse des Futters von Atlantischem Lachs mittels der Größenausschlusschromatographie induktiv gekoppelter Plasma-Massenspektrometrie liefert Daten über die in der löslichen Fraktion gefundenen chemischen Zinkspezies.
In dieser Fraktion sind fünf zinkhaltige Peaks mit jeweils unterschiedlichem Molekulargewicht zu sehen. Die in der löslichen Fraktion vorkommenden Zinkchemikalienarten können unterschiedliche Quellen haben, da das verwendete Futter sowohl marine als auch pflanzliche Inhaltsstoffe enthält und ergänzt wird. Der Molekulargewichtsbereich dieser Spezies legt nahe, dass diese Verbindungen Metalloproteine sein könnten.
Während die Löslichkeit von ergänzten Zink 65 das Vorhandensein aller getesteten Aminosäuren erhöht, wird bei Histidin und Lysin eine höhere Löslichkeit festgestellt. Die apikale Zinkaufnahme in Arteca GC-Zellen wird signifikant durch das Vorhandensein von L-Met oder DL-Met bei zwei millimolaren Konzentrationen beeinflusst. Darüber hinaus wird der Einfluss von Methionin auf die Zinkaufnahme durch das Vorhandensein von BCH negativ beeinflusst.
Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass wir versucht haben, verschiedene Ansätze in visuellen, analytischen und Invivo-Studien zu kombinieren, um uns gegenseitig zu vergleichen und zu ergänzen, wenn es um die Untersuchung der Verfügbarkeit von Mineralien geht.
