Der Umfang unserer Forschung umfasst die Entwicklung und Validierung einer nicht-invasiven Methode zur Messung des Kohlenstoffgehalts in Atemwegsmakrophagen als Biomarker für die Exposition gegenüber kohlenstoffhaltigem Feinstaub. Unser Ziel ist es, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit dieser Methode der groß angelegten individuellen Expositionsabschätzung zu ermitteln. Unser Protokoll bietet eine nicht-invasive, präzise und standardisierte Methode zur Messung des Kohlenstoffgehalts in Makrophagen der Atemwege.
Als interner Expositions-Biomarker handelt es sich dabei um eine effektiv und genaue individuelle Exposition gegenüber kohlenstoffhaltigem Feinstaub. Unser Protokoll bietet einen direkten, zuverlässigen Biomarker für die individuelle Exposition gegenüber kohlenstoffhaltigem Feinstaub. Diese Methode ermöglicht eine großflächige Quantifizierung mit induziertem Sputum, was sowohl die Genauigkeit als auch die Zuverlässigkeit im Vergleich zu anderen Techniken erhöht.
Beginnen Sie mit der Entnahme einer zwei Milliliter schweren Sputumprobe in einem Zentrifugenröhrchen. Geben Sie dann 20 bis 30 Milliliter der vorbereiteten Fixierlösung in das Röhrchen und mischen Sie den Inhalt gründlich. Um die Verdauungslösung für die Zellsuspension herzustellen, lösen Sie 0,1 Gramm Dithiothreitol in 100 Millilitern Kochsalzlösung entsprechend der erforderlichen Dosierung auf.
Zentrifugieren Sie nun das Röhrchen mit dem Auswurf bei 1.998 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie dann den Überstand. Geben Sie dem Niederschlag das gleiche Volumen an Sputumverdau.
Die Mischung aufreiben und gründlich schütteln. Legen Sie die Tube anschließend in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, bis sie sich vollständig verflüssigt hat. Anschließend filtrieren Sie das verflüssigte Gemisch mit einer 70-Mikrometer-Filtermembran.
Die filtrierte Lösung wird bei 500 g sieben Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie die Zelle ausfallen. Resuspendieren Sie nun den Zellniederschlag in Duchennephosphatpuffer.
Die Lösung wird sieben Minuten lang bei 500 g bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um einen reinen Zellausfall zu erhalten. Für die Vorbereitung des Zellabstrichs geben Sie 200 bis 600 Mikroliter Phosphatpuffer in das Zellsediment und mischen Sie es gründlich. Nehmen Sie dann 20 Mikroliter der Zellsuspension und erstellen Sie einen Zellabstrich.
Fixieren Sie den getrockneten Abstrich 10 Sekunden lang mit einer handelsüblichen Färbelösung. Tauchen Sie anschließend den Abstrich acht Sekunden lang in Färbelösung A. Heben Sie den Objektträger während des Färbens vorsichtig auf und ab und spülen Sie dann überschüssigen Fleck mit fließendem Wasser ab.
In den Zellen wurden kleine Aggregate von deutlich sichtbaren Rußpartikeln beobachtet, die sich in der Menge der Kohlenstoffpartikel unterschieden. Zu Beginn stellen Sie die gefärbten Sputum-Objektträger unter einem Mikroskop dar. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip gut gefärbte und morphologisch intakte Makrophagen aus und nehmen Sie deren Bilder auf.
Messen Sie mit der ImageJ-Software den Maßstab für eine genaue Pixelkonvertierung. Wählen Sie Messen aus, und klicken Sie auf Maßstab festlegen. Geben Sie die Entfernung in Pixel, die tatsächliche Länge, und die Längeneinheit in Mikrometern ein.
Aktivieren Sie dann die Option Global. Umranden Sie nun die Zellen mit einer unregelmäßigen Form und entfernen Sie den Hintergrund mit Hilfe der Freihandauswahl. Wählen Sie unter Bearbeiten die Option "Außen löschen" aus.
Messen Sie die Gesamtfläche der Zellen mit Analysieren und Messen. Schneiden Sie den Kern mit Bearbeiten und Ausschneiden aus. Um das Graustufenbild in Schwarzweiß umzuwandeln.
Klicken Sie auf Bild, Typ und 8-Bit. Um den Graustufenwert basierend auf der Zellfärbung anzupassen, um Kohlenstoffpartikel genau zu zählen, gehen Sie zu Bild, wählen Sie "Anpassen", "Schwellenwert" und "Anwenden". Klicken Sie abschließend auf Analysieren und wählen Sie Messung.
Arbeiter bei der Verpackung von Ruß hatten einen höheren Kohlenstoffgehalt in den Makrophagen der Atemwege als die Kontrollgruppe.
