Das vorgestellte Protokoll ermöglicht die Quantifizierung eines breiten Spektrums von Lipiden in tierischem Gewebe. Es ist ein einfaches Werkzeug, um Lipidmechanismen zu untersuchen und auch Biomarker zu identifizieren, die auf eine frühe Toxizität in Tiermodellen hinweisen. Die Methode liefert ein quantitatives Profil von mehr als 400 molekularen Lipiden in 14 verschiedenen Lipidklassen in einer Vielzahl von Probenmatrizes mit einer Trendzeit von 10 Minuten pro Probe.
Zu Beginn verdünnen Sie den Zentrifugen-Aliquot-1-Überstand in der doppelten Konzentration mit Ammoniumbicarbonat-Puffer. Nach der Herstellung der Rinderserumalbumin-Standardkurve die Standardröhrchen wirbeln und die Röhrchen bei 18, 200 g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugieren. Übertragen Sie aus den zuvor vorbereiteten Standardröhrchen jeweils 6 Mikroliter des Rohlings, der Standards und der Proben auf eine 96-Well-Flachbodenplatte.
Als nächstes geben Sie 250 Mikroliter des Bradford-Reagenzes mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung und mischen Sie. Messen Sie nach 5-minütiger Inkubation die Absorption bei einer Wellenlänge von 595 Nanometern mit einem Plattenleser. Bereiten Sie 2 Milliliterröhrchen mit 100 Mikrolitern Ammoniumbicarbonatlösung in jedes Röhrchen des Gesamtleerwerts und des internen Standardrohlings vor und bewahren Sie alle Proben auf Eis auf.
Bereiten Sie Qualitätskontrollproben vor, wobei zu berücksichtigen ist, dass zwischen jedem Satz von 10 Proben eine Qualitätskontrollprobe platziert wird. Geben Sie 10 Mikroliter gepooltes menschliches Plasma in 2-Milliliter-Röhrchen und geben Sie dann 10 Mikroliter interne Standardlösung in alle internen Standard-Blind-, Qualitätskontroll- und Studienproben. Zu jeder Probe 300 Mikroliter minus 20 Grad Celsius Butanol-Methanol-Gemisch geben und bei 450 g 10 Minuten bei Raumtemperatur auf Thermomixer schütteln.
Als nächstes werden 300 Mikroliter Heptan-Ethylacetat-Gemisch zugegeben und bei 450 g 10 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer geschüttelt, dann 300 Mikroliter 1%ige Asketinsäuremischung hinzugefügt und 5 Minuten bei 450 g bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer geschüttelt. Zentrifugieren Sie bei 2.800 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und überführen Sie 360 Mikroliter der oberen Phase in ein neues 2-Milliliter-Selbstverschlussröhrchen, das als 2 gekennzeichnet ist. Nach Zugabe von 320 Mikrolitern Heptanethylacetat zu dem mit 1 gekennzeichneten Wasserphasenröhrchen wird es 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer bei 450 g geschüttelt und dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2.800 g zentrifugiert, wie zuvor gezeigt.
Übertragen Sie 320 Mikroliter der oberen Phase und kombinieren Sie sie mit der Fraktion aus dem vorherigen Schritt in Röhrchen 2. Ebenso 250 Mikroliter Heptanethylacetat in die Wasserphase in Röhrchen 1 geben und bei 450 g 5 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Thermomischer schütteln. Erneut bei 2.800 g 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren, dann 200 Mikroliter der oberen Phase übertragen und mit den Fraktionen aus den vorherigen Schritten in Röhrchen 2 kombinieren.
In einem Vakuumkonzentrator bei 35 Grad Celsius zur Trockene eindampfen und in 300 Mikrolitern MS-Mischlösung wieder auflösen. Jedes Röhrchen 5 Sekunden lang schwenken, um sicherzustellen, dass sich alles auflöst, und bei 18.200 g 5 Minuten bei 4 Grad Celsius zentrifugieren. Übertragen Sie ein Aliquot von 50 Mikrolitern in die Mikroliterplatte für die Analyse des positiven Ionisationsmodus und verdünnen Sie es mit 50 Mikrolitern MS-Mischlösung.
Verdünnen Sie erneut mit 80 Mikrolitern MS-Mischung und übertragen Sie ein Aliquot von 20 Mikrolitern in die MTP-Platte für die Analyse des negativen Ionisationsmodus. Wickeln Sie die Platte mit Folie ein und halten Sie sie vor der Analyse bei 4 Grad Celsius. Kalibrieren Sie ein MS sowohl im positiven als auch im negativen Modus gemäß den Anweisungen des Herstellers 5 Tage oder weniger vor der Analyse.
Installieren Sie die Direktinfusions-Nanoquelle im Voraus und stellen Sie sicher, dass sie richtig an der Transferkapillare des MS und einem 4,1-Mikrometer-Düsenchip in den Chiphalter ausgerichtet ist, und überprüfen Sie dann die Parameter für positive und negative Infusionen, die einem Gasdruck von 1,25 psi, einer Quellspannung von 1,1 Kilovolt und 5 Mikrolitern Probeninjektionsvolumen entsprechen. Ausgangskontaktverschluss Rel1 für 2,5 Sekunden, 5 Minuten Lieferzeit, Plattenkühlung bei 4 Grad Celsius, dann den Temperaturregler einrichten und eine neue Platte erstellen. Überprüfen und stellen Sie die Software für den positiven Modus ein, dass die MS-Methode mit einer Kapillartemperatur von 250 Grad Celsius und einem HF-Wert des S-Objektivs von 65,0 eingerichtet ist. Öffnen Sie in der Xcalibur-Software die positive Methode und überprüfen Sie, ob die MS-Erfassung mit vollem Scan von null bis 1 Minute im Bereich von 550 bis 1.000 m/z bei einer Auflösung von 140.000 mit automatischer Verstärkungsregelung von 1 Million und maximaler Injektionszeit von 50 Millisekunden eingestellt ist.
Wenden Sie eine Sperrmasse von 680,48022 an. Vergewissern Sie sich, dass die datenunabhängige MS/MS-Erfassungsmethode zwischen dem 1- und 5-Minuten-Zeitbereich mit einer Auflösung von 17.500 und einer festen Anfangsmasse von 250 m/z eingerichtet ist. Prüfen Sie, ob die automatische Verstärkungsregelung für MS2 auf 100.000 und eine maximale Einspritzzeit auf 64 Millisekunden, eine Kollisionsenergie von 20 NCE, das Isolationsfenster auf 1 m/z eingestellt ist und dass eine Einschlussmassenliste von 398 bis 1.100 m/z mit einem Massenschritt von 1 Dalton verwendet wird.
Überprüfen Sie für die Erfassung im negativen Modus in der Tune-Software, dass die MS-Methode mit einer Kapillartemperatur von 250 Grad Celsius in der HF-Stufe der S-Linse bei 65,0 in der MS-Tune-Datei eingerichtet ist. Überprüfen Sie als Nächstes in der Xcalibur-Software, ob der Full-Scan-Erfassungsmodus von null bis 1 Minute mit einer Auflösung von 140.000 eingerichtet ist, die den Bereich von 400 bis 940 m/z, eine automatische Verstärkungsregelung von 1 Million, eine maximale Einspritzzeit von 200 Millisekunden und eine Sperrmasse von 526,46262 abdeckt. Überprüfen Sie, ob die MS2-Erfassung im DIA-Modus zwischen 1 und 5 Minuten des Laufs mit einer Auflösung von 17.500 mit einer festen Anfangsmasse von 150 m/z, einer automatischen Verstärkungsregelung von 100.000, einer maximalen Einspritzzeit von 64 Millisekunden und einer maximalen Kollisionsenergie von 35 NCE unter Verwendung der Einschlussmassenliste von 400 bis 940 mit einem Massenschritt von 1 Dalton eingerichtet ist.
Erstellen Sie die Analysesequenzwarteschlange in der Xcalibur-Software im positiven Modus und lösen Sie sie aus, erstellen Sie dann die Sequenz in der ChipSoft-Software und starten Sie die Analyse, während Sie darauf warten, dass die Probenaufnahme durch ein Kontaktschließsignal ausgelöst wird, das vom Direktinfusionsroboter für jede Probe kommt. Wenn die Analyse im positiven Modus abgeschlossen ist, erstellen Sie die Warteschlange für die Analysesequenz in der Xcalibur-Software im negativen Modus und lösen Sie sie aus, erstellen Sie dann die Sequenz in der ChipSoft-Software und starten Sie die Analyse, während Sie darauf warten, dass die Probenaufnahme durch ein Kontaktschließsignal ausgelöst wird, das vom Direktinfusionsroboter für jede Probe kommt. Die normalisierte Gesamtlipidkonzentration wurde aus den 14 am häufigsten vorkommenden Lipidklassen identifiziert und quantifiziert, die für die Lipidklassen PE, PEO, PC, PCO, PI und PG leicht erhöht war und für SM-, LPE- und PA-Lipide eine gewisse Herunterregulierung beobachtet wurde.
Während bei TAGs und PS kein Unterschied zu sehen war. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass unter den molekularen Merkmalen, die auf der gesamten Summenformel basieren, 100 bis 120 Verbindungen signifikant durch die Exposition gegenüber Zigarettenrauch beeinflusst wurden. Die Dekonvolution der MS2-Fragmentierung und die Normalisierung der Fragmentsignalintensitäten ermöglichten die nähere Definition der Gesamtmenge jeder konjugierten Fettsäure, die in jedem Lipidglas vertreten ist, und den Vergleich dieser Daten zwischen exponierten und Kontrollgruppen. Es wurde eine Abnahme der vollständig gesättigten und wenigen ungesättigten Fettsäuren beobachtet, während die mehrfach ungesättigten Fettsäuren in der Zusammensetzung der PC-, PE- und PG-Phospholipidklassen in der Zigarettenrauchgruppe für alle Zeitpunkte erhöht waren.
Die extremen Fälle von PC und PG, die mit Eicosapentaensäure und Docosahexaensäure konjugiert waren, wurden ausschließlich in der 3R4F CS-Expositionsgruppe nachgewiesen. Das Pipettieren der Probe und der QC-Probe muss mit Low-Band-Spitzen erfolgen und genau sein, was bedeutet, dass die Spitzen zwischen den einzelnen Proben überprüft werden müssen. Das Pipettieren der internen Standardlösung ist kritisch und muss genau sein.
Die Lösung von 1 zu 1 Dichlormethan-Methanol muss mit Vorsicht gehandhabt werden, und es muss ein nicht weichmacherhaltiger Spitzen verwendet werden, um zu vermeiden, dass Kunststoffpolymere in den Proben vorhanden sind. Die Spitzen müssen zwischen den einzelnen Proben gewechselt werden.
