Mit dieser Methode kann die Expression von Zielproteinen im Zebrafischherz genau und einfach nachgewiesen werden. Die Veränderung des Zielproteins wird direkt durch Messung der Immunfluoreszenz nachgewiesen. Führen Sie die Entnahme und Behandlung von Zebrafischembryonen durch, wie im Textmanuskript beschrieben.
72 Stunden nach der Befruchtung werden die Embryonen auf Glasobjektträger übertragen und unter einem Stereomikroskop beobachtet. Zeichnen Sie Herzfehlbildungen wie Perikardödeme, veränderte Schleifen und verminderte Größe auf. Berechnen Sie Die Fehlbildungsraten und analysieren Sie Die Unterschiede zwischen den Gruppen mit einer Einweg-ANOVA, gefolgt vom Mehrfachvergleichstest der Türkei.
Nach der Betäubung der Embryonen mit 0,6 Milligramm pro Milliliter MS222 zeichnen Sie die Herzschläge für 30 Sekunden auf und quantifizieren die Herzfrequenz mit der Image J-Software. Sezieren Sie sorgfältig Herzen aus den Zebrafischembryonen mit einer Einwegspritzennadel unter einem Stereomikroskop. Verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um einen Kreis auf einem sauberen Glasträger zu zeichnen.
Fügen Sie 50 Mikroliter 4% Paraformaldehyd zu 1,25 Mikrolitern PBS hinzu, um eine fixierende Lösung herzustellen, legen Sie dann drei sezierte Herzen in einen hydrophoben Barrierekreis und inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie die Lösung unter dem Mikroskop und trocknen Sie die Proben bei Raumtemperatur für mindestens fünf Minuten. Waschen Sie die Dias dreimal in PBST für fünf Minuten pro Waschgang.
Fügen Sie 50 Mikroliter BSA zu 1.000 Mikroliter PBST hinzu, um eine 5% ige BSA-Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Objektträger eine Stunde lang in einer feuchten Kammer, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang. Verdünnen Sie zwei Mikroliter monoklonaler Mausantikörper gegen 8-Hydroxydeoxyguanosin und zwei Mikroliter polyklonaler Kaninchenantikörper gegen Gamma-H2AX in 296 Mikroliter PBST, um eine funktionierende primäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten.
Inkubieren Sie die Herzproben mit 50 Mikrolitern der primären Antikörper-Cocktaillösung in einer befeuchteten Kammer für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBST für fünf Minuten pro Waschgang. Verdünnen Sie einen Mikroliter FITC-markierten sekundären Ziegen-Anti-Maus-Antikörper und einen Mikroliter Psy-3-Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in 500 Mikroliter PBST, um eine funktionierende sekundäre Antikörper-Cocktaillösung zu erhalten.
Inkubieren Sie die Proben mit den sekundären Antikörpern eine Stunde lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Dekantieren Sie die Lösung und waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang. Fügen Sie 20 Mikroliter DAPI zu den Proben hinzu, um sie kernlich zu färben, und inkubieren Sie sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Tragen Sie einen Deckzettel auf den Schlitten auf und versiegeln Sie ihn mit Nagellack, um Trocknung und Bewegung zu verhindern. Stellen Sie die Proben unter einem Fluoreszenzmikroskop ab und quantifizieren Sie das Fluoreszenzsignal des Herzbereichs mit der ImageJ-Software. Berechnen Sie die relativen Änderungen anhand des Durchschnitts der DMSO-Kontrollstichproben und bestimmen Sie die statistische Signifikanz der Daten.
Embryonen, die in Abwesenheit oder Anwesenheit des Antioxidans N-Acetyl-L-Cystein oder NAC pm 2,5 ausgesetzt waren, wurden auf das Vorhandensein von Herzfehlbildungen untersucht. EOM von PM 2,5 kostete eine signifikante Zunahme der kardialen Teratogenese, wie Perikardödem, veränderte Schleifen und verringerte Größe, im Vergleich zu DMSO-Kontroll-behandelten Herzen. Die Herzfrequenz war auch bei Embryonen, die EOM ausgesetzt waren, signifikant verringert.
Zugabe von NAC-abgeschwächten EOM-induzierten Herzfehlern. Ein Immunfluoreszenz-Assay wurde verwendet, um das Ausmaß der DNA-Schädigung in EOM-behandelten Geweben zu bewerten. Die Spiegel der 8-Hydroxydesoxyguanosin- und Gamma-H2AX-Expression waren in den Herzen von Zebrafischembryonen, die mit EOM behandelt wurden, signifikant erhöht, was auf eine Zunahme oxidativer DNA-Schäden bzw. DNA-Doppelstrangbrüche hindeutet.
Dem EOM-induzierten DNA-Schaden wurde teilweise durch nac-Supplementierung entgegengewirkt. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, achten Sie beim Waschen der Proben mit PBS, da sich das Zebrafischherz vom Objektträger ablösen kann.
