Wir möchten die finanzielle Unterstützung aus dem MRC UK (G0800498) quittieren. Wir möchte auch danken Professor JM Fritschy, Universität Zürich, für die Bereitstellung der GABA A -R-Untereinheit-spezifischen γ2 Antikörper und Professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, für die Bereitstellung der pcDNA 3.1 (+) Expressionsvektoren, die Antibiotika-Resistenz Gene für die Herstellung von stabil transfizierten HEK293-Zelllinien.

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	<li>Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+role+of+GABA+in+cortical+development.">Defining the role of GABA in cortical development.</a> J Physiol. 587, 1873-1879 (2009).</li><li>Ben-Ari, Y., Khalilov, I., Kahle, K. T., Cherubini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GABA+excitatory/inhibitory+shift+in+brain+maturation+and+neurological+disorders.">The GABA excitatory/inhibitory shift in brain maturation and neurological disorders.</a> The Neuroscientist : a review journal bringing neurobiology, neurology and psychiatry. 18, 467-486 (2012).</li><li>Structure Sieghart, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pharmacology,+and+function+of+GABAA+receptor+subtypes.">pharmacology, and function of GABAA receptor subtypes.</a> Adv Pharmacol. 54, 231-263 (2006).</li><li>Unwin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitter+action:+opening+of+ligand-gated+ion+channels.">Neurotransmitter action: opening of ligand-gated ion channels.</a> Cell. 72, 31-41 (1993).</li><li>Homanics, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+devoid+of+gamma-aminobutyrate+type+A+receptor+beta3+subunit+have+epilepsy,+cleft+palate,+and+hypersensitive+behavior.">Mice devoid of gamma-aminobutyrate type A receptor beta3 subunit have epilepsy, cleft palate, and hypersensitive behavior.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4143-4148 (1997).</li><li>Gunther, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine-insensitive+mice+generated+by+targeted+disruption+of+the+gamma+2+subunit+gene+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Benzodiazepine-insensitive mice generated by targeted disruption of the gamma 2 subunit gene of gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7749-7753 (1995).</li><li>Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptor+diversity+and+pharmacology.">GABA(A) receptor diversity and pharmacology.</a> Cell Tissue Res. 326, 505-516 (2006).</li><li>Low, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+neuronal+substrate+for+the+selective+attenuation+of+anxiety.">Molecular and neuronal substrate for the selective attenuation of anxiety.</a> Science. 290, 131-134 (2000).</li><li>Rudolph, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benzodiazepine+actions+mediated+by+specific+gamma-aminobutyric+acid(A)+receptor+subtypes.">Benzodiazepine actions mediated by specific gamma-aminobutyric acid(A) receptor subtypes.</a> Nature. 401, 796-800 (1999).</li><li>Rudolph, U., Knoflach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+classical+benzodiazepines:+novel+therapeutic+potential+of+GABAA+receptor+subtypes.">Beyond classical benzodiazepines: novel therapeutic potential of GABAA receptor subtypes.</a> Nat Rev Drug Discov. 10, 685-697 (2011).</li><li>Hulst, C., Atack, J. R., Kooy, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complexity+of+the+GABAA+receptor+shapes+unique+pharmacological+profiles.">The complexity of the GABAA receptor shapes unique pharmacological profiles.</a> Drug Discov Today. 14, 866-875 (2009).</li><li>Essrich, C., Lorez, M., Benson, J. A., Fritschy, J. M., Luscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+clustering+of+major+GABAA+receptor+subtypes+requires+the+gamma+2+subunit+and+gephyrin.">Postsynaptic clustering of major GABAA receptor subtypes requires the gamma 2 subunit and gephyrin.</a> Nat Neurosci. 1, 563-571 (1998).</li><li>Schweizer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gamma+2+subunit+of+GABA(A)+receptors+is+required+for+maintenance+of+receptors+at+mature+synapses.">The gamma 2 subunit of GABA(A) receptors is required for maintenance of receptors at mature synapses.</a> Mol Cell Neurosci. 24, 442-450 (2003).</li><li>Belelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrasynaptic+GABAA+receptors:+form,+pharmacology,+and+function.">Extrasynaptic GABAA receptors: form, pharmacology, and function.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 12757-12763 (2009).</li><li>Connolly, C. N., Wooltorton, J. R., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors+is+determined+by+receptor+beta+subunits.">Subcellular localization of gamma-aminobutyric acid type A receptors is determined by receptor beta subunits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 9899-9904 (1996).</li><li>Connolly, C. N., Krishek, B. J., McDonald, B. J., Smart, T. G., Moss, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+cell+surface+expression+of+heteromeric+and+homomeric+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptors.">Assembly and cell surface expression of heteromeric and homomeric gamma-aminobutyric acid type A receptors.</a> J Biol Chem. 271, 89-96 (1996).</li><li>Klausberger, T., Roberts, J. D., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-+and+input-specific+differences+in+the+number+and+subtypes+of+synaptic+GABA(A)+receptors+in+the+hippocampus.">Cell type- and input-specific differences in the number and subtypes of synaptic GABA(A) receptors in the hippocampus.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 2513-2521 (2002).</li><li>Thomson, A. M., Jovanovic, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+synapse-specific+clustering+of+GABA(A)+receptors.">Mechanisms underlying synapse-specific clustering of GABA(A) receptors.</a> Eur J Neurosci. 31, 2193-2203 (2010).</li><li>Fritschy, J. M., Panzanelli, P., Tyagarajan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+functional+heterogeneity+of+GABAergic+synapses.">Molecular and functional heterogeneity of GABAergic synapses.</a> Cell Mol Life Sci. 69, 2485-2499 (2012).</li><li>Ali, A. B., Thomson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+alpha+5+subunit-containing+GABAA+receptors+mediate+IPSPs+elicited+by+dendrite-preferring+cells+in+rat+neocortex.">Synaptic alpha 5 subunit-containing GABAA receptors mediate IPSPs elicited by dendrite-preferring cells in rat neocortex.</a> Cereb Cortex. 18, 1260-1271 (2008).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P., Hughes, D. I., Pawelzik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+sensitivity+to+Zolpidem+of+IPSPs+activated+by+morphologically+identified+CA1+interneurons+in+slices+of+rat+hippocampus.">Differential sensitivity to Zolpidem of IPSPs activated by morphologically identified CA1 interneurons in slices of rat hippocampus.</a> Eur J Neurosci. 12, 425-436 (2000).</li><li>Nyiri, G., Freund, T. F., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input-dependent+synaptic+targeting+of+alpha(2)-subunit-containing+GABA(A)+receptors+in+synapses+of+hippocampal+pyramidal+cells+of+the+rat.">Input-dependent synaptic targeting of alpha(2)-subunit-containing GABA(A) receptors in synapses of hippocampal pyramidal cells of the rat.</a> Eur J Neurosci. 13, 428-442 (2001).</li><li>Treutlein, B., Gokce, O., Quake, S. R., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartography+of+neurexin+alternative+splicing+mapped+by+single-molecule+long-read+mRNA+sequencing.">Cartography of neurexin alternative splicing mapped by single-molecule long-read mRNA sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 1291-1299 (2014).</li><li>Siddiqui, T. J., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organizing+complexes.">Synaptic organizing complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 21, 132-143 (2011).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+architecture+of+cell+adhesion+mediated+by+polymorphic+synaptic+adhesion+molecules+neurexin+and+neuroligin.">Higher-order architecture of cell adhesion mediated by polymorphic synaptic adhesion molecules neurexin and neuroligin.</a> Cell reports. 2, 101-110 (2012).</li><li>Krueger, D. D., Tuffy, L. P., Papadopoulos, T., Brose, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+neurexins+and+neuroligins+in+the+formation,+maturation,+and+function+of+vertebrate+synapses.">The role of neurexins and neuroligins in the formation, maturation, and function of vertebrate synapses.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 412-422 (2012).</li><li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons.">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li><li>Graf, E. R., Zhang, X., Jin, S. X., Linhoff, M. W., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurexins+induce+differentiation+of+GABA+and+glutamate+postsynaptic+specializations+via+neuroligins.">Neurexins induce differentiation of GABA and glutamate postsynaptic specializations via neuroligins.</a> Cell. 119, 1013-1026 (2004).</li><li>Dong, N., Qi, J., Chen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+reconstitution+of+functional+GABAergic+synapses+with+expression+of+neuroligin-2+and+GABAA+receptors.">Molecular reconstitution of functional GABAergic synapses with expression of neuroligin-2 and GABAA receptors.</a> Mol Cell Neurosci. 35, 14-23 (2007).</li><li>Fuchs, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA(A)+receptors+can+initiate+the+formation+of+functional+inhibitory+GABAergic+synapses.">GABA(A) receptors can initiate the formation of functional inhibitory GABAergic synapses.</a> Eur J Neurosci. 38, 3146-3158 (2013).</li><li>Ventimiglia, R., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culturing nerve cells: Rat striatal neurons in low-density, serum-free culture. , 371-393 (1998).</li><li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localization+of+GABA(A)+receptor+subunits+in+relation+to+rat+striatopallidal+and+pallidopallidal+synapses.">Differential localization of GABA(A) receptor subunits in relation to rat striatopallidal and pallidopallidal synapses.</a> Eur J Neurosci. 33, 868-878 (2011).</li><li>Fritschy, J. M., Mohler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA-receptor+heterogeneity+in+the+adult+rat+brain:+differential+regional+and+cellular+distribution+of+seven+major+subunits.">GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits.</a> J Comp Neurol. 359, 154-194 (1995).</li><li>Doig, N. M., Moss, J., Bolam, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+thalamic+innervation+of+direct+and+indirect+pathway+medium-sized+spiny+neurons+in+mouse+striatum.">Cortical and thalamic innervation of direct and indirect pathway medium-sized spiny neurons in mouse striatum.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 14610-14618 (2010).</li><li>Lalchandani, R. R., Vicini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+collaterals+in+genetically+identified+medium+spiny+neurons+in+mouse+primary+corticostriatal+cultures.">Inhibitory collaterals in genetically identified medium spiny neurons in mouse primary corticostriatal cultures.</a> Physiological reports. 1, (2013).</li><li>Nusser, Z., Sieghart, W., Benke, D., Fritschy, J. M., Somogyi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+synaptic+localization+of+two+major+gamma-aminobutyric+acid+type+A+receptor+alpha+subunits+on+hippocampal+pyramidal+cells.">Differential synaptic localization of two major gamma-aminobutyric acid type A receptor alpha subunits on hippocampal pyramidal cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 11939-11944 (1996).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unbiased+expression+screen+for+synaptogenic+proteins+identifies+the+LRRTM+protein+family+as+synaptic+organizers.">An unbiased expression screen for synaptogenic proteins identifies the LRRTM protein family as synaptic organizers.</a> Neuron. 61, 734-749 (2009).</li><li>Pettem, K. L., Yokomaku, D., Takahashi, H., Ge, Y., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+autism-linked+MDGAs+and+neuroligins+suppresses+inhibitory+synapse+development.">Interaction between autism-linked MDGAs and neuroligins suppresses inhibitory synapse development.</a> J Cell Biol. 200, 321-336 (2013).</li><li>Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+discovery+of+glypican+as+a+receptor+for+LRRTM4+in+regulating+excitatory+synapse+development.">Unbiased discovery of glypican as a receptor for LRRTM4 in regulating excitatory synapse development.</a> Neuron. 79, 696-711 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Obwohl dieses Protokoll ist technisch schwierig durchzuführen, gibt es mehrere wichtige Schritte, die befolgt werden müssen, um die genaue und reproduzierbare Co-Kultur-Assays erreicht werden. Erstens muss kultiviert mittelgroßen Projektionsneuronen bei einer optimalen Dichte ausgesät werden. Wenn ausgesät zu dünn, neigen Neuronen sehr langsam entwickeln und Überleben stark reduziert. Auf der anderen Seite, wenn zu dicht ausgesät, neigen Neuronen zu aggregieren, die die Analyse der Kontakte mit HEK293-Zellen beeinträchtigt. Zweitens ist es empfehlenswert, transient exprimieren ein fluoreszierendes Reporter, GFP oder mCherry in HEK293-Zellen, die GABA A Rs vor platting sie in dem Co-Kultur. Dies ermöglicht die zuverlässige Erkennung von HEK293-Zellen, die durch die Ähnlichkeit in der Form und Größe zwischen diesen Zellen und seltene Hinter Gliazellen in neuronalen Kulturen beeinträchtigt werden kann. Die effiziente Transfektion mit GFP oder mCherry cDNA zu erreichen, müssen in der exponentiellen Wachstumsphase werden HEK293-Zelllinien undin der geeigneten Dichte in 6-well Platten ausgesät. Sparse Aussaat gefolgt von Transfektion verursacht Zellen schlecht wachsen, während Über Aussaat werden die Zellen aus der Aufnahme der cDNA zu verhindern. Idealerweise sollten die Zellen ausgesät werden, dass sie zwischen 70 - 90% konfluent waren am Tag der Transfektion. Drittens muss der Transfektion für jede Zelllinie optimiert werden, da einige Zelllinien sind empfindlicher als andere. Dies ist, weil eine konstitutive GABA A R-Expression in HEK293-Zellen reduziert das Überleben der Zelle und die Fähigkeit der Zellen nach Transfektion erholen. Außerdem hängt das Überleben von der Art des GABA A Rs in HEK293-Zellen exprimiert, wobei einige Zelllinien deutlich empfindlicher als die anderen. Transfektion mit liposomalen Reagenz ist eine optimale Verfahren zur Expression von Fremdproteinen in schnell wachsenden Zelllinien, die sowohl die hohe Transfektionseffizienz und Expressionsniveau. Führt dies jedoch zu viel Reagenz Beschädigung langsam wachsende Zelllinien, beispielsmit denen wir regelmäßig eine nicht-liposomale Transfektionsreagenz. Dies funktioniert in einer ähnlichen Weise zu der liposomalen Reagenz aber die Menge an DNA für die effiziente Transfektion benötigt wird deutlich reduziert. Dies ermöglicht eine größere Zellüberlebensrate (etwa 80 bis 90% gegenüber 60% mit Liposomen Reagenz), jedoch mit geringer Transfektionseffizienz (60%). Schließlich / β2 / γ2 HEK293-exprimierenden Zellen zu neuronalen Kulturen zugesetzt muss die Anzahl der Steuer HEK293 oder α1 optimiert werden. Hinzufügen zu wenige Zellen beeinträchtigt die erfolgreiche Analyse der Kontakte zwischen HEK293-Zellen und Neuronen, weil sie sehr selten geworden. Umgekehrt Zu viele HEK293-Zellen verursacht neuronalen Zelltod innerhalb von wenigen Stunden. Embryonale mittelgroßen Projektionsneuronenkulturen sollte idealerweise mit striatalen Gewebe aus embryonalen Alter von 15 Jahren seziert hergestellt werden - 17. Allerdings kommt es oft vor, dass Embryonen sind etwas jünger oder älter als die optimale Alter. In diesem Fall ist die Anzahl der Neuronen in Kultur angeimpft wirdmüssen verändert werden. Gewebe, die jünger als E15 müssen möglicherweise bei einer etwas niedrigeren Dichte ausgesät werden, während Gewebe, das älter als E17 müssen möglicherweise mit einer höheren Dichte ausgesät werden, um ein optimales Zellüberleben zu ermöglichen. Weiterhin müssen Cytosinarabinosid (Ara-C), um älteren Kulturen zugesetzt werden, um das Wachstum von Gliazellen, die häufiger bei älteren Gewebe verhindern. Beim Erstellen Co-Kulturen, ist es wichtig, die optimierte Anzahl von transfizierten HEK293 oder α1 / β2 / γ2 HEK293 Zellen exprimiert Platte, wie oben erwähnt. Jedoch kann es notwendig sein, das für jede einzelne Zelllinie aufgrund von Unterschieden in ihren Lebensrate zu bestimmen. Typischerweise 30.000 Zellen in einem Volumen von 50 ul zu jedem Well einer 24-Well-Platte, das bereits 500 ul neuronalen Kulturmedium gegeben werden, da dies sicherstellt, dass das konditionierte Medium neuronalen nicht zu stark verdünnt, und dass die Bedingungen innerhalb jeder Vertiefung weitgehend konstant bleiben, zB </em&gt; Die Konzentration der Wachstumsfaktoren. Hinzufügen Volumes größer als 50 &amp; mgr; l in jede Vertiefung würde generell töten die Neuronen. Einer der Hauptnachteile der Co-Kultur-Technik ist, daß die neuronalen Kulturen von dissoziierten Zellen als Monoschicht, was bedeutet, dass die Neuronen von ihren normalen Mikro entfernt und können ihre normale anatomische Organisation zu etablieren gewachsen erstellt. Daher fehlt ihnen die entsprechenden Verbindungen, Ein- und sekretierte Moleküle von anderen Zellen, die die Anfangsstadien der Synapsenentwicklung beeinflussen. Beispielsweise in vivo mittelgroßen Projektionsneuronen sind dicht von glutamatergen Eingaben von dem Cortex, Thalamus und anderen Hirnregionen 34 innerviert, jedoch in unserer neuronalen Kulturen glutamatergen Synapsen nicht bilden, da diese Eingänge werden bei der Präparation des striatalen Gewebe beschädigt. Wie das Fehlen von funktionellen glutamatergen Synapsen in kultivierten mittelgroßen Projektionsneuronen affECTS ihre Fähigkeit, GABAergen Synapsen untereinander und / oder HEK293-Zellen, die GABA A Rs bilden, bleibt eine offene Frage. Diese Frage könnte leicht durch Züchten zusammen mittelgroßen Projektionsneuronen mit kortikalen glutamatergen Neuronen damit sie in funktionelle Synapsen 35 vor der Zugabe von HEK293 Zellen bilden adressiert werden. Ein alternativer Ansatz wäre, eine Co-Kultur-Modell System zu entwerfen, basierend auf organotypischen Schnittkulturen, die einige der Zellarchitektur, die wichtig für die Reifung und Synapsenbildung sein kann halten. Allerdings haben organotypischen Schnittkulturen dichten und heterogenen Neuropil, das die Analyse hier geführt gefährden können. Ein weiterer wichtiger Nachteil der Verwendung von Co-Kultur-Assays ist, dass GABA A Rs ausgedrückt auf der Oberfläche der HEK293-Zellen werden nicht gruppiert, wie sie in Neuronen, obwohl dies scheint nicht Synapsenbildung gegeben eine ausreichend hohe Oberflächenexpressions 30 notwendig. Zum Beispiel wird in der r-Odent Gehirn und in Hippocampus-Kulturen, die α1 GABA A R-Untereinheit ist in den meisten GABAergen Synapsen auf allen postsynaptischen Domänen von Pyramidenzellen gefunden. Jedoch ist die α2 und zwar in einer Untergruppe von Synapsen auf der Zellkörper und Dendriten sind, aber ist sehr im Axon Anfangssegment angereichert durch Immunofluoreszenz und Elektronenmikroskopie 36 offenbart. Da die Synapsenbildung in den Co-Kulturen immer noch zuverlässig erkannt und analysiert werden 30 legt dies nahe, dass die Dichte des GABA A Rs auf der Zelloberfläche von HEK293-Zellen kann ähnlich oder sogar höher als die Dichte dieser Rezeptoren im synaptischen sein Clustern in Neuronen. Dies kann erklären, zumindest teilweise, warum synaptischen Adhäsionsproteine ​​wie neuroligin und postsynaptischen Dichte Proteine ​​wie Gephyrin, sind nicht für die Synapsenbildung in den Co-Kulturen notwendig, wenn man die entsprechend montiert GABA A Rs vorhanden sind bei ausreichender Dichte. Es ist gut dokumentiert, dass GABA A Rs sind strukturell und funktionell heterogen, dass die Rezeptor-Untereinheit-Zusammensetzung bestimmt ihre subzelluläre Lokalisierung und pharmakologischen Eigenschaften. Beispielsweise wird der Einbau von 2-Untereinheiten bekannt, die Voraussetzung für die synaptische Lokalisation des GABA A Rs, während die Untereinheit ist fast ausschließlich in Gegenwart extrasynaptischen GABA A Rs. Die Rezeptoren, die nur αβ Kombinationen einzubeziehen sind auch gedacht, um in erster Linie zu den extrasynaptischen Domains 12- 14 lokalisiert werden. Ob diese Spezifität wird in unserer co-Kultursystem aufrechterhalten kann leicht durch transiente Transfektion von cDNAs Einheit 2 oder in HEK293-Zelllinien, die stabil α und β-Untereinheiten, bevor sie auf neuronale Kulturen getestet werden. Unsere Vorversuche unter Verwendung dieses Ansatzes haben vorgeschlagen, dass die synaptische Kontakte werden einfach nur in Gegenwart der 2-Untereinheit gebildet wird, anzeigt, daß das spezifischeficity in vivo beobachtet wurde, ist wahrscheinlich in vitro erhalten werden (Daten nicht gezeigt). Weiterhin sind GABA A Rs Einbeziehung verschiedener α-Untereinheiten selektiv an synaptischen Kontakte mit bestimmten Arten von präsynaptischen Neuronen gebildet lokalisiert. Zum Beispiel im Globus pallidus, die α1-GABA A Rs werden im allgemeinen bei striatopallidalen (str-GP) und palliopallidal (GP-GP) Synapsen, die auf Dendriten und somatischen Bereiche der mittelgroßen Projektionsneuronen befinden, jeweils zu finden. Die α3-GABA A Rs werden in perisomatische Regionen mittelgroßen Projektionsneuronen und werden von lokalen GP Axonkollateralen kontaktiert, während die α2-GABA A Rs beruhen auf distalen Dendriten dieser Nervenzellen und in erster Linie durch die Eingänge aus dem Striatum 32 kontaktiert. Expression von spezifischen α-Untereinheiten in verschiedenen Arten von Synapsen und Neuronen in verschiedenen Kompartimenten wurde auch in anderen Hirngebieten wie Hipp nachgewiesenocampus 21 und Neocortex 18,20. Diese Ergebnisse werfen die Frage auf, wie die spezifische inhibitorische Synapsen im Gehirn gebildet wird. Ist die Haftung von einer bestimmten Art von präsynaptischen Terminal induzieren die Einfügung spezifischer GABA A R-Subtypen in die Berührungspunkte? Werden die Rezeptoren spezifischen subzellulären Orten Handel nach ihrer Zusammensetzung Einheit, wobei die Plasmamembran Insertion ist eine Voraussetzung für die Haftung der axonalen Klemmen bestimmter Herkunft? Bis heute bleiben diese Fragen unbeantwortet. Die Verwendung von reduzierten Modellsystemen, wie die Co-Kultur-Modell-System, ermöglichen es uns, beginnen Beantwortung dieser komplexen Fragen, da das System leicht zugänglich Transfektion von DNA-Konstrukten und Anwendung von Reagenzien und, besonders wichtig, geeignet für Live Cell Imaging-Analyse ist es 30. Somit ist die Verwendung dieses Modellsystem können wir beginnen die Prüfung der Rolle der einzelnen Moleküle, darunter verschiedene Arten von GABA A Rs, weißn auf synaptische Kontakte vorhanden sein. Ein weiterer Vorteil ist, dass Synapsen in diesem Modellsystem Form schnell, innerhalb von Minuten bis Stunden, Verkürzung der Dauer der Experimente. Ähnliche Cokulturmodell Systeme wurden in der Vergangenheit erfolgreich eingesetzt, um für die neuen synaptogenic Moleküle 27,37,38 screenen. Verstehen, wie das zentrale Nervensystem entwickelt, reift und Formen Verbindungen zwischen Nervenzellen, so kunstvoll zu kontrollieren, zum Beispiel Verhalten oder Kognition, ist von grundlegender Bedeutung. Dieser entfernte Ziel wird nur durch Abgrenzung der molekularen Mechanismen, die die einzelnen Schritte der Anerkennung und von Zelle zu Zelle Kommunikation während der Entwicklung regieren erreicht werden. Durch schiere Komplexität, die molekularen Details dieser vielfältigen zellulären Interaktionen können derzeit mit Präzision nur in reduzierter Systeme untersucht werden. Allerdings ist die Fähigkeit, die Komplexität dieser Systeme durch Ausdrücken mehrere Kombinationen von Proteinen und untersucht, wie erhöhensie interagieren hat einige Vorteile im Vergleich zu beispielsweise genetische Deletion Ansätze. Denn die genaue Interpretation der Auswirkungen eines einzelnen Gens Deletion wird oft durch Veränderungen mit Kompensationsmechanismen Maskierung der Wirkung der ursprünglichen Läsionen, insbesondere bei der Entwicklung des Gehirns assoziiert beeinträchtigt. Die hier beschriebene einfache, aber informative Co-Kultur-Technik hat eine Entdeckung der strukturellen Rolle der GABA A Rs in Synapsenbildung erlaubt und eröffnete eine Möglichkeit zu untersuchen, wie GABA A Rs und andere Zelladhäsionsmoleküle und / oder synaptische Matrixproteine ​​miteinander interagieren während Synaptogenese. Synaptic Matrixproteine ​​sind von besonderem Interesse, da sie vor kurzem nachgewiesen, dass sie eine Schlüsselrolle in glutamatergen Synapse Formation 39 zu spielen. Weiterentwicklung der Co-Kultur-Modelle ist wichtig, weil sie das Potenzial haben, unser Wissen über die molekularen Mechanismen, die zu führen der &quot;normale &amp; voran# 8217; Entwicklung des Gehirns und damit unser Verständnis, wie diese Mechanismen werden in vielen der Entwicklung des Nervenerkrankungen, wie Epilepsie, Schizophrenie, Autismus-Spektrum-Störungen und viele andere verändert.

GABA ist einer der frühesten embryonalen Neurotransmitter im Gehirn, vor der am häufigsten vorkommende exzitatorische Neurotransmitter Glutamat 1. Während der Entwicklung depolarisiert GABA und regt unreifen Neuronen, die eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Zellproliferation, Migration und Bildung von neuronalen Netzwerken ohne eine Exzitotoxizität. Im erwachsenen Gehirn wird das Umkehrpotential für GABA A Rezeptorkanäle zu negativeren Potentialen aufgrund einer Abnahme der intrazellulären Konzentration von Chlor verschoben. Diese Verschiebung wird durch die Hochregulation des Kaliumchlorid-Co-Transporter (KCC2), das Chlorid aus der Zelle transportiert verursacht wird, und, parallel dazu, die Herunterregulierung der Natrium-Kalium-Chlorid-Transporter (NKCC1), die aufweist der gegenteilige Effekt 2. Im Gehirn GABA bindet primär entweder GABA A oder GABA B Rezeptoren, die schnell oder langsam synaptische Hemmung vermitteln jeweiligely. GABA A Rs sind eine Klasse von Rezeptoren auch als heteropentameren ionotrope oder Liganden-gesteuerte Cys-Loop-Ionenkanäle bekannt. Zwei Moleküle GABA zur Aktivierung des Rezeptors, die durchlässig für Chlorid-Ionen und in geringerem Ausmaß, Bicarbonat-Ionen erforderlich. Der Anstieg der Chloridleitfähigkeit verringert die Wirksamkeit der depolarisierenden, exzitatorischen Ereignisse in der Aktivierung der postsynaptischen Neuron 3. Strukturvielfalt der GABA A Rs ist seit langem als ein Schlüsselfaktor bei der Bestimmung ihrer breiten Palette von funktionellen und pharmakologischen Eigenschaften erkannt worden. Nativen GABA A Rs sind hetero-Pentamere von Untereinheiten mit mehreren Isoformen klassifiziert zusammensetzt: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, θ π und 3, mit einem gemeinsamen Transmembrantopologie mit einer großen N-terminalen extrazellulären Domäne, vier Transmembrandomänen (TMS) und eine intrazelluläre Hauptdomäne zwischen TMs 3 und 4 4. Dasβ3 und γ2 Untereinheiten sind für die synaptische Inhibition und Organismus überleben, weil Mäusen mit genetischen Löschung dieser Untereinheiten sterben nach der Geburt 5,6. Im Gegensatz dazu sind einzelnen Isoformen von α-Untereinheit für die Funktion des spezifischen synaptischen Verbindungen im Gehirn mit unterschiedlichen Verhaltensweisen wie Angst, Sedierung, Erregung und andere verbunden sind, sind nicht einzeln für das Leben wesentlich 7-9 aber. GABA A Rs sind die Hauptwirkorte für eine Vielzahl von Medikamenten mit starken Beruhigungsmittel, hypnotisch, angstlösende und krampflösende Wirkungen, wie Benzodiazepine, Barbiturate, Neuro und Anästhetika 7,10,11. Synaptic GABA A Rs enthalten typischerweise eine γ2-Untereinheit, zwei β-Untereinheiten (am häufigsten β2 oder β3) und zwei α-Untereinheiten (α1, α2, α3 oder α5) 12,13. Die vorherrschende Klasse von extra synaptischen Rezeptoren die δ-Untereinheit in Kombination enthältmit zwei α-Untereinheiten (α4 oder α6) und zwei β-Untereinheiten (β2 oder β3) 14. Subzelluläre Lokalisierung von GABA A Rs Axone, Dendriten oder Soma und Insertion in die Plasmamembran sind abhängig von der Gegenwart von β-Untereinheiten 15,16. Jedoch selektiven Einbau von verschiedenen GABA A R Subtypen in verschiedene Arten von Synapsen korreliert gut mit der Anwesenheit von spezifischen α-Untereinheiten (α1, α2, α3 oder α5) 7,17,18. Wichtig ist, dass das Löschen von α1 oder α2-Untereinheit in Mäusen bewirkt ultrastrukturelle Veränderungen bei hemmende Synapsen 19. Dies deutet darauf hin, dass GABA A Rs selbst können bei der Regulierung der Synapsenbildung eine direkte Rolle spielen. Beweise zeigen, dass GABAerge Synapsen Entwicklung ist eine präzise koordinierten Abfolge der Ereignisse, bei denen sowohl die neuronalen Ziele durch verschiedene Arten von Inhibitor Axonen und den Rezeptoren, die auf Cluster kontaktiertjede Klasse von hemmenden Synapsen sind selektive und funktional abgestimmt 17,20-22. Dieses Grundprinzip der Spezifität bei GABAergen Synapsen stellt sich die Frage, wie die prä- und postsynaptischen Partnern während der Einleitung der synaptischen Kontakte gegenseitig erkennen. In-vitro-Co-Kultur-Assays wurden erfolgreich eingesetzt, um einige der Mechanismen der Synapsenbildung zu untersuchen und die Rolle der einzelnen synaptischen Spalt überspannende Proteine ​​in diesem Verfahren getestet werden. Eines der gemeinsamen trans synaptischen interacting protein-Kombinationen, die bidirektional mit Synapsenbildung und Reifung vermitteln funktionieren, sind die Neurexine (Nrxns) und Neuroligine (NLS). Nrxns sind präsynaptischen Proteine, die das alternative Spleißen innerhalb ihrer Laminin-neurexin-Sexualhormon-bindendes Protein-Domänen aufweisen, was zu vielen unterschiedlichen Isoformen 23. Während die Nrxns auch mit anderen Proteinen interagieren, sind NLs dachte ihrer ubiquitären postsynaptischen partner 24. Zusammen bilden diese Proteine ​​tragen zur Aufnahme der präsynaptischen und postsynaptischen Membranen in enger und starrer Apposition 25. Die beiden am häufigsten vorkommenden Isoformen sind NL-1 und NL-2, die an erregenden und hemmenden Synapsen, jeweils 26 vorhanden sind. Eines der frühesten Cokulturmodell Systeme designt trans synaptische Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, verwendeten verschiedene Arten von nicht-neuronalen Zellen, am häufigsten unsterbliche Zelllinien, wie menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293-Zellen, zu über-express NL- 2. Wenn diese Zellen mit pontis Neuronen kultiviert wurde eine Akkumulation von präsynaptischen Proteinen in der Nähe der Oberfläche der HEK-Zellen beobachtet, was die Bildung von Synapsen artigen Kontakten. Zugabe von löslichem β-neurexin diesen Co-Kulturen hemmte die Bildung von Kontakten, was darauf hindeutet, dass trans-synaptischen Interaktionen zwischen Nrxns und NLs für synaptische Kontaktbildung 27 notwendig sind. Außerdem transiente Expressionvon β-neurexin in COS (C V-1 (Simian) in O Rigin und Tragen des S V40 Erbgut) Zellen co-kultiviert mit dissoziierten hippocampalen glutamatergen und GABAergen Neuronen induziert die Expression des postsynaptischen Protein gephryin und der GABA A R-Untereinheiten γ2 und α2 an Kontaktpunkten zwischen diesen beiden Zelltypen 28. Ein weiteres Beispiel einer Co-Kultur-Modell zur Synapsenbildung Studie beteiligten HEK293-Zellen, die transient mit GABA A R transfizierten Untereinheiten α2 / β3 / γ2 und NL-2 und eine Mischpopulation von Hypothalamus Neuronen 29. Diese Studie ergab, dass die Expression von NL-2 ist eine absolute Voraussetzung für die Bildung von inhibitorischen Synapsen. Doch in der letzten Co-Kultur-Studie stabil transfizierten α1 / β2 / γ2 GABA A Rs in HEK293-Zellen wurden als ausreichend funktionelle Synapsen zu veranlassen, wenn co-kultiviert mit GABAergen medium Projektionsneuronen, ohne die Notwendigkeit für zusätzliche trans-synaptische oder postsynaptischen Adhäsionsproteine. Allerdings wurde ein prominenter Anstieg Synapsenbildung und Festigkeit beobachtet, wenn NL-2 wurde mit GABA A Rs 30 koexprimiert. Dies deutet darauf hin, dass diese Co-Kultur-Modell-System hat Vorteile gegenüber zuvor beschriebenen Modellsysteme, die meisten offenbar eine erhöhte Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der synaptischen Kontakterkennung. Zwei wichtige Faktoren für die Verbesserung der Gesamterfassungs der synaptischen Kontakte sind: i) Die Verwendung von stabil transfizierten HEK293-Zelllinien mit hoher und konstanter Ausdruck GABA A R-Untereinheiten an der Oberfläche der einzelnen Zellen. Diese Konsistenz erleichtert quantitative Vergleiche zwischen verschiedenen Co-Kulturbedingungen. ii) Die Verwendung einer reinen Population von GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums embryonalen 31 kultiviert entfernt Komplikationen und Unklarheiten bei der Verwendung von gemischten neuronalen Populationen und resultierende allows, beispielsweise die Auswahl der am besten geeigneten postsynaptischen GABA A R-Typen, die bei der Synapsenbildung miteinander verglichen werden können. Bildung von Synapsen wird gedacht, um viele trans-synaptischen Signale innerhalb prä- und postsynaptischen Zelladhäsion Komplexe beinhalten. Aufgrund der bidirektionalen Natur des synaptischen Signalisierung und die bloße Anzahl von Zelladhäsionsmolekülen, ist es schwierig, die Schlüsselkomponenten in der Synapsenbildung beteiligt sind. Somit Transfektion einer einzigen Zelladhäsionsprotein in eine nicht-neuronalen Zelle (in diesem Fall sind die beiden am häufigsten postsynaptischen Ziele für GABAerge mittelgroßen Projektionsneuronen in vivo, α1 / β2 / γ2 oder α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) erheblich reduziert die Komplexität der trans-synaptische Signale an postsynaptischen Oberfläche und ermöglicht eine genaue quantitative Analyse der Wirksamkeit dieses Proteins bei der Förderung der Synapsenbildung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1601">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:469px;">Name</td>
			<td style="width:627px;">Company/Individual</td>
			<td style="width:111px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:396px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">DMEM (Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11960-044</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25030-024</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15070-063</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">FBS (Fetal Bovine Serum)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10106-169</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">21103-049</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">B27 Supplement</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">17504-044</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glucose</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G8769</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HBSS (10X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">14180-046</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15630-056</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">PBS (1X)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10010-031</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection)</td>
			<td rowspan="2" style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">V790-20</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V860-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:469px;">pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">V870-20</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Stable HEK&#945;1&#946;2&#947;2 line</td>
			<td style="width:627px;">Sanofi-Synthelabo, Paris</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-D-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P1149</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">G418 disulfate salt (Geneticin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G5013</td>
			<td style="width:396px;">Danger: irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Phleomycin D1 (Zeocin)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">R25001</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10687-010</td>
			<td style="width:396px;">Danger: toxic, irritant and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">25300-054</td>
			<td style="width:396px;">Warm in water bath at 37 &#176; &#1057; before use Danger: Irritant.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Poly-L-lysine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">P6282</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Laminin</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">L2020</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">100 &#956;m Nylon Cell Strainer</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">734-0004</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Cytosine &#946;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">C1768</td>
			<td style="width:396px;">Danger: Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Chelating agent (Versene)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15040-033</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:469px;">liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent).</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">15338-100</td>
			<td style="width:396px;">Alternative transfection method: Effectene Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent)</td>
			<td style="width:627px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:111px;">301425</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Reduced serum medium (Opti-MEM)</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">11058-021</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">105311C5</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Neurobasal A</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">10888-022</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:627px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:111px;">27810.364</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Glycine</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">G1726</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">BSA (Bovine Serum Albumin)</td>
			<td style="width:627px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">A3294</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="64" rowspan="3" style="height:64px;width:469px;">Guinea pig anti-&#947;2 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Prof. Jean Marc Fritschy</td>
			<td rowspan="3" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="3" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:627px;">(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">J. Comp. Neurol. 359 (1) 154&#8211;194 (1995).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:627px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">H5141</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB351</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-synapsin antibody</td>
			<td style="width:627px;">Synaptic Systems</td>
			<td style="width:111px;">106-011</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Mouse anti-&#946;2/3 antibody (BD17)</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">MAB341</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:469px;">Rabbit anti-&#945;1 GABAA receptor antibody</td>
			<td style="width:627px;">Professor Anne Stephenson</td>
			<td rowspan="2" style="width:111px;">N/A</td>
			<td rowspan="2" style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:627px;">(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP1085</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:111px;">AP124S</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A31553</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A21422</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;">Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody</td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">A11008</td>
			<td style="width:396px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:469px;"><a name="RANGE!A49">Mounting reagent (Prolong Gold)</a></td>
			<td style="width:627px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:111px;">P36930</td>
			<td style="width:396px;">Use at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inhibitory synapse formation in a co-culture model incorporating gabaergic medium spiny neurons and hek293 cells stably expressing gabaa receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (&#947;-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials. 
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other. 
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.

Das Protokoll für diese Neuron-HEK293 Zell Cokulturmodell System wurde fein abgestimmt, um eine optimale Zellüberleben zu ermöglichen. In diesem System Synapsenbildung förmigen Kontakte und deren Analyse beruht auf stabile und konsistente Expression aller drei GABA A R-Untereinheiten, die in einen funktionellen Rezeptor zu montieren. Es ist daher wichtig, immunzytochemische Analyse von Testeinheit für die Expression an der Oberfläche der HEK293-Zelle, bevor sie auf neuronale Kulturen verwenden. In diesen Experimenten wurde die Zelloberflächenexpression von α1, β2 und γ2-Untereinheiten (1A), oder α1, β3 und γ2-Untereinheiten (1B), unter Verwendung von Untereinheit-spezifischen Antikörpern, die an die extrazelluläre Epitope dieser Untereinheiten zu binden, nachgewiesen. Ein hoher Grad der Co-Lokalisierung zwischen den Untereinheiten im HEK293 Oberfläche nachgewiesen. Nach der Bestätigung der Oberflächenexpression und Co-Lokalisierung von GABA AR-Untereinheiten in HEK293-Zellen, Co-Kulturen wurden mit HEK293-Zellen, die α1 / β2 / γ2 GABA A R-Untereinheiten und mittelgroßen Projektionsneuronen für 14 Tage (14 Tage in vitro (DIV)) kultiviert vorbereitet. Zellen in Co-Kultur wurden für 24 h inkubiert, fixiert und mittels Immunzytochemie und konfokale Mikroskopie analysiert. Analyse zeigte, daß Kontakte GAD65-positiven GABAergen Axonterminalen gebildet nur sporadische Kontakte mit den Steuer HEK293-Zellen (2A, 2B). Die Zahl der Kontakte bei 4 h nachgewiesen betrug 7,3 ± 0,9 pro HEK293 Zell, und diese Zahl wurde auf 5,5 ± 0,5 Anschlüsse (Mittelwert ± SEM) pro HEK293-Zelle bei 24 Stunden nach Zugabe von HEK293-Zellen zu den kultivierten Neuronen reduziert. Im Gegensatz dazu gebildet GAD65-positiven GABAergen Axonterminalen zahlreiche Synapsen-ähnliche Kontakte mit HEK293-Zellen, die GABA A Rs. Die Anzahl der Kontakte in 4 h nach der Zugabe von HEK293-Zellen erhalten wurde, betrug 28,3 ± 4,7 HEK293-Zelle, und diese Zahl wurde weitere Steigerungd auf 52,1 ± 6,3 (Mittelwert ± SEM) pro HEK293-Zelle bei 24 h in Co-Kultur (2A, 2B). Um festzustellen, ob diese Synapse artigen Kontakte waren &quot;aktiv&quot;, dh unterstützt vesikulären Transmitterfreisetzung wurde ein Vesikel-luminale Domäne-spezifischen Anti-Synaptotagmin Cy5-konjugierten Antikörpers an die Co-Kulturmedium nach 23 Stunden Inkubation zugegeben. Dieser Antikörper wird nur in präsynaptischen Nervenenden eingearbeitet, wenn eine Pore bildet sich zwischen den synaptischen Vesikel Lumen und der extrazellulären Flüssigkeit in dem synaptischen Spalt in die Neurotransmitter-Freisetzung. Nach der Freigabe, schließt sich das Poren, so dass die Synaptotagmin Cy5-konjugierten fluoreszierenden Antikörper gegen Synaptotagmin angebracht innerhalb der Vesikel. Auf diese Weise werden nur die Vesikel aktiv an Neurotransmitterfreisetzung in Eingriff mit dem Antikörper markiert. In diesen Experimenten wenige oder gar keine Kontakte zwischen dem Steuer HEK293-Zellen und die mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals waren &quot;aktiv &amp; #8217; wie durch das Fehlen der Co-Lokalisierung von präsynaptischen GAD65 / synaptotagmin Fluoreszenz und Fluoreszenz mCherry in HEK293-Zellen (3A) dargestellt. Im Gegensatz dazu wurden viele &quot;aktive&quot; Kontakte zwischen den mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals und α1 / β2 / γ2-exprimierenden HEK293-Zellen, wie durch einen hohen Grad an Co-Lokalisation zwischen GAD65 / Synaptotagmin und mCherry ergab, ausgedrückt speziell in HEK293-Zellen (gebildet 3B). Um zu testen, ob ein anderer Subtyp des GABAA-R kann auch Synapse artige Ausbildung in vitro zu fördern, haben wir co-kultiviert α1 / β3 / γ2 exprimierenden HEK293 Zellen mit mittelgroßen Projektionsneuronen. Auch Steuer HEK293-Zellen nur selten empfangen Kontakte mit Synapsin-positive präsynaptischen Enden erreicht 10,8 ± 0,48 (Mittelwert ± SEM) Kontakte pro HEK293 Zell nach 24 h in Co-Kultur (4A links, 4B). Jedoch HEK293-Zellen,α1 / β3 / γ2 GABA A Rs Form deutlich mehr Synapsen-ähnliche Kontakte mit Synapsin-positive präsynaptischen Enden von mittelgroßen Projektionsneuronen erreicht 25,3 ± 0,27 (Mittelwert ± SEM) Kontakte pro HEK293 Zell nach 24 h in Co-Kultur (4A rechts, 4B). Dies zeigt, dass α1 / β3 / γ2 GABA A Rs in HEK293-Zellen exprimiert sind ebenfalls in der Lage, synaptische Kontaktbildung zu fördern, wenn auch ihre Potenz niedriger als die Potenz α1 / β2 / γ2 enthaltenden GABA A Rs ist. Diese Experimente zeigen, dass die Co-Kultur-Modellsystem in unserem Labor entwickelt ermöglicht quantitative Analyse der synaptischen Kontaktbildung in vitro sowie die Bewertung der Wirksamkeit der verschiedenen Subtypen von GABA A Rs in diesem Prozess. Diese Experimente zeigen weiter, dass die GABA A Rs, zusätzlich zu der kritischen Funktionskomponenten GABAergen Synapsen, kann eine wichtige Rolle spielenbei der Erkennung und der Bildung von synaptischen Kontakten zwischen inhibitorischen Neuronen und den entsprechenden neuronalen Zielzellen, die unabhängig von anderen Synapsen Adhäsionsproteine. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" width="600" /> Abbildung 1 Immuncytochemische Analyse der Expression von GABA A R α1 / β2 / γ2 oder α1 / β3 / γ2 in stabiler HEK293-Zelllinien. Antikörper, die die extrazellulären Domänen von GABA A R-Untereinheiten wurden auf Label-Rezeptoren an der Zelloberfläche ausgedrückt wird. ( A) HEK293 Zelllinie, α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) und γ2 (Cy5) auf hohem Niveau. (B) HEK293 Zelllinie, α1 (Alexa Fluor 488), β2 (Alexa Fluor 555) und γ2 (Cy5)Untereinheiten auf einem hohen Niveau. Maßstab:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" width="600" /> Abbildung 2 GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen bilden Synapsenartige Kontakte mit α1 / β2 / γ2- exprimierenden HEK293-Zellen in Co-Kultur. (A) Die Fluoreszenzmarkierung der präsynaptischen Enden mit Anti-GAD65-Antikörper (grün) und HEK293-Zellen mit mCherry (rot, links) oder die GABA A R γ2-Untereinheit (in blau, rechts), ergab Punkte Kolokalisation zwischen diesen Markierungen, die Synapsenbildung förmigen Kontakte nach 4 bzw. 24 h in Co-Kultur. Maßstab:. 10 um (B) Quantitative Analyse der Synapsenartigen Co<html> ntacts. HEK293-Zellen wurden identifiziert auf der Basis ihrer Form, wie von der DIC-Bildgebung und / oder mCherry Expression, und die Anzahl der Kontakte zwischen den GAD 65-positive Pünktchen (grün) und der Oberfläche der HEK293-Zellen offenbart wurde, mit dem Auge in jedem optischen Abschnitt eine gezählte Z-Stapelreihe (8 - 10) pro Zelle unter Verwendung der Bildbearbeitungssoftware und ausgedrückt als die Zahl der Kontakte / Zelle. Die Grafik zeigt die Anzahl der Kontakte zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen und Kontrolle HEK293-Zellen (hellgrau) oder α1 / β2 / γ2-HEK293-Zellen (schwarz) nach 4 und 24 h in Co-Kultur (Mittelwert ± SEM, n = 8 in jedem Zustand aus zwei unabhängigen Experimenten). Diese Zahl wurde von Fuchs et al modifiziert. (2013) 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> ad / 52115 / 52115fig3highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Abbildung 3. GABA A Rs fördern Bildung aktiver synaptischer Kontakte. Immunmarkierung von Synapse artigen Kontakte nach 24 Stunden in Co-Kultur zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen Terminals positiv für GAD65 gebildet (Alexa Fluor 405 cyan) und (A) Steuer HEK293-Zellen oder (B) HEK293-α1 / β2 / γ2-Zellen, die transient mit beiden mCherry Konstrukt (rot). Aktive Kontakte werden durch Co-Lokalisation zwischen der Vesikel Lumendomänenspezifische Anti Synaptotagmin Antikörper (Cy5) und GAD65-spezifischen Antikörpers sowohl in präsynaptischen Enden identifiziert und mCherry in HEK293-Zellen exprimiert. Maßstab:. 10 um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> ild 4 &quot;fo: content-width =&quot; 6in &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52115 / 52115fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Abbildung 4. GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen bilden Synapsenartige Kontakte mit α1 / β3 / γ2- Einheit exprimierenden HEK293-Zellen in Co-Kultur. (A) Fluoreszenzmarkierung von präsynaptischen Enden mit Anti-Synapsin I-Antikörper (in grün) und Steuer HEK293-Zellen (links), oder α1 / β3 / γ2 exprimierenden HEK293-Zellen, sowohl transient mit mCherry transfiziert (in rot), offenbarte Punkte Co-Lokalisation zwischen diesen Markierungen, die die Bildung von Synapsen förmigen Kontakte nach 24 h in Co-Kultur. Maßstab: 10 &amp; mgr; m (B). Die quantitative Analyse der Synapsenartigen Kontakten. HEK293-Zellen wurden durch mCherry Expression identifiziert, und die Anzahl der Kontakte zwischen Synapsin I-positive Pünktchen (grün) und der Oberfläche der HEK293-Zellen wurde mit dem Auge in jedem optischen Abschnitt einer Z-Stapelreihe gezählt (8 - 10) pro Zelle mit Imaging-Software, und als die Anzahl der Kontakte / Zelle. Die Grafik zeigt die Anzahl der Kontakte zwischen mittelgroßen Projektionsneuronen und Kontrolle HEK293-Zellen (hellgrau) oder α1 / β3 / γ2-HEK293-Zellen (schwarz) nach 24 h in Co-Kultur (Mittelwert ± SEM, n = 8-12 Zellen in jede Bedingung, aus zwei unabhängigen Experimenten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52115/52115fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Die molekularen Mechanismen, die während der Ontogenese koordinieren die Bildung von inhibitorischen GABAergen Synapsen sind weitgehend unbekannt. Um diese Prozesse zu untersuchen, haben wir eine Co-Kultur-Modellsystem, das embryonale mittelgroßen Projektions GABAergen Neuronen zusammen mit stabil transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK293-Zellen) exprimieren funktionellen GABA-A-Rezeptoren enthält, kultiviert entwickelt.

Hemmende Synapse Formation in einer Co-Kultur Modell mit GABAergen mittelgroßen Projektionsneuronen und HEK293-Zellen, die GABA<sub&gt; A</sub&gt; Receptors

Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

17.3K Aufrufe.  University College London.  Die molekularen Mechanismen, die während der Ontogenese koordinieren die Bildung von inhibitorischen GABAergen Synapsen sind weitgehend unbekannt. Um diese Prozesse zu untersuchen, haben wir eine Co-Kultur-Modellsystem, das embryonale mittelgroßen Projektions GABAergen Neuronen zusammen mit stabil transfizierten humanen embryonalen Nieren-293 (HEK293-Zellen) exprimieren funktionellen GABA-A-Rezeptoren enthält, kultiviert entwickelt. 

Serie: Inhibitory Synapse Formation in a Co-culture Model Incorporating GABAergic Medium Spiny Neurons and HEK293 Cells Stably Expressing GABAA Receptors

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and learning and memory. There are four known families of PKC isoforms in vertebrates: classical PKCs (&alpha;, &beta;I, &beta;II and &gamma;), novel type I PKCs (&#949; and &eta;), novel type II PKCs (&delta; and &theta;), and atypical PKCs (&zeta; and &iota;). The classical PKCs are activated by Ca2+ and diacylclycerol (DAG), while the novel PKCs are activated by DAG, but are Ca2+-independent. The atypical PKCs are activated by neither Ca2+ nor DAG. In Aplysia californica, our model system to study memory formation, there are three nervous system specific PKC isoforms one from each major class, namely the conventional PKC Apl I, the novel type I PKC Apl II and the atypical PKC Apl III. PKCs are lipid-activated kinases and thus activation of classical and novel PKCs in response to extracellular signals has been frequently correlated with PKC translocation from the cytoplasm to the plasma membrane. Therefore, visualizing PKC translocation in real time in live cells has become an invaluable tool for elucidating the signal transduction pathways that lead to PKC activation. For instance, this technique has allowed for us to establish that different isoforms of PKC translocate under different conditions to mediate distinct types of synaptic plasticity and that serotonin (5HT) activation of PKC Apl II requires production of both DAG and phosphatidic acid (PA) for translocation 1-2. Importantly, the ability to visualize the same neuron repeatedly has allowed us, for example, to measure desensitization of the PKC response in exquisite detail 3. In this video, we demonstrate each step of preparing Sf9 cell cultures, cultures of Aplysia sensory neurons have been described in another video article 4, expressing fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells and in Aplysia sensory neurons and live-imaging of PKC translocation in response to different activators using laser-scanning microscopy.

In this video, we demonstrate visualization of PKC translocation in living cells using fluorescently tagged PKCs.

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

Bilaminäre Co-Kultur von primären Ratten-kortikalen Neuronen und Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells

Human primary muscle cells cultured aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of a nerve component, cell differentiation is limited and motor neuron stimulation is missing1. These limitations hamper the in vitro study of many neuromuscular diseases in cultured muscle cells. Importantly, the experimental constraints of monolayered, cultured muscle cells can be overcome by functional innervation of myofibers with spinal cord explants in co-cultures.
Here, we show the different steps required to achieve an efficient, proper innervation of human primary muscle cells, leading to complete differentiation and fiber contraction according to the method developed by Askanas2. To do so, muscle cells are co-cultured with spinal cord explants of rat embryos at ED 13.5, with the dorsal root ganglia still attached to the spinal cord slices. After a few days, the muscle fibers start to contract and eventually become cross-striated through innervation by functional neurites projecting from the spinal cord explants that connecting to the muscle cells. This structure can be maintained for many months, simply by regular exchange of the culture medium.
The applications of this invaluable tool are numerous, as it represents a functional model for multidisciplinary analyses of human muscle development and innervation. In fact, a complete de novo neuromuscular junction installation occurs in a culture dish, allowing an easy measurement of many parameters at each step, in a fundamental and physiological context.
Just to cite a few examples, genomic and/or proteomic studies can be performed directly on the co-cultures. Furthermore, pre- and post-synaptic effects can be specifically and separately assessed at the neuromuscular junction, because both components come from different species, rat and human, respectively. The nerve-muscle co-culture can also be performed with human muscle cells isolated from patients suffering from muscle or neuromuscular diseases3, and thus can be used as a screening tool for candidate drugs. Finally, no special equipment but a regular BSL2 facility is needed to reproduce a functional motor unit in a culture dish. This method thus is valuable for both the muscle as well as the neuromuscular research communities for physiological and mechanistic studies of neuromuscular function, in a normal and disease context.

Cultured muscle cells are an inadequate model to recapitulate innervated muscle in vivo. A functional motor unit can be reproduced in vitro by innervation of differentiated human primary muscle cells using rat embryo spinal cord explants. This article describes how co-cultures of spinal cord explants and muscle cells are established.

Ein Functional Motor Unit in der Kulturschale: Co-Kultur von Spinal Cord Explantate und Muskelzellen

Human primary muscle cells cultured  aneurally in monolayer rarely contract spontaneously because, in the absence of  a nerve component, cell ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Dorsalwurzelganglien Neuronen und differenzierten Fettgewebe gewonnene Stammzellen: Eine<em&gt; In-vitro-</em&gt; Co-Kultur Modell zur Regeneration peripherer Nerven Studieren

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) axons form branches and synapses in specific layers of the cerebral cortex. Despite the obvious spatial correlation between axon branching and synapse formation, the causal relationship between them is poorly understood. To address this issue, we recently developed a method for simultaneous imaging of branching and synapse formation of individual TC axons in organotypic cocultures.
This protocol describes a method which consists of a combination of an organotypic coculture and electroporation. Organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex facilitate gene manipulation and observation of axonal processes, preserving characteristic structures such as laminar configuration. Two distinct plasmids encoding DsRed and EGFP-tagged synaptophysin (SYP-EGFP) were co-transfected into a small number of thalamic neurons by an electroporation technique. This method allowed us to visualize individual axonal morphologies of TC neurons and their presynaptic sites simultaneously. The method also enabled long-term observation which revealed the causal relationship between axon branching and synapse formation.

This protocol describes a method for simultaneous imaging of thalamocortical axon branching and synapse formation in organotypic cocultures of the thalamus and cerebral cortex. Individual thalamocortical axons and their presynaptic terminals are visualized by a single cell electroporation technique with DsRed and GFP-tagged synaptophysin.

Visualisierung von Thalamocortical Axon Verzweigung und Synapse Bildung in organotypischen Kokulturen

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can be cultured in defined media for 16 days in vitro and are amenable to any analyses typically performed on dissociated cultures, including electrophysiological, morphological and survival analyses. The major advantage of these cultures is that specific cell types can be selectively studied in the absence of complex external influences, such as those arising from glial cells or other neuron types. When planning experiments with purified cells, however, it is important to note that neurons strongly depend on glia-conditioned media for their growth and survival. In addition, glutamatergic neurons further depend on glia-secreted factors for the establishment of synaptic transmission. We therefore also describe a method for co-culturing neurons and glial cells in a non-contact arrangement. Using these methods, we have identified major differences between the development of GABAergic and glutamatergic neuronal networks. Thus, studying cultures of purified neurons has great potential for furthering our understanding of how the nervous system develops and functions. Moreover, purified cultures may be useful for investigating the direct action of pharmacological agents, growth factors or for exploring the consequences of genetic manipulations on specific cell types. As more and more transgenic animals become available, labeling additional specific cell types of interest, we expect that the protocols described here will grow in their applicability and potential.

This protocol describes a cell sorting based method for the purification and culture of fluorescent GABAergic or glutamatergic neurons from the neocortex and hippocampus of postnatal mice or rats.

Primärzellkultur von gereinigten Gurified GABAergic oder Glutamatergic Neuronen, die durch Fluoreszon-Sortierung gegründet wurden

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials through saltatory conduction. Moreover, an increasing number of reports suggest that oligodendrocytes interact with neurons beyond myelination, notably through the secretion of soluble factors. Here, we present a detailed protocol allowing purification of oligodendroglial lineage cells from glial cell cultures also containing astrocytes and microglial cells. The method relies on overnight shaking at 37 &#176;C, which allows selective detachment of the overlying oligodendroglial cells and microglial cells, and the elimination of microglia by differential adhesion. We then describe the culture of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM). We also provide the kinetics of OCM treatment or oligodendrocytes addition to purified hippocampal neurons in co-culture experiments, studying oligodendrocyte-neuron interactions.

Herein, we display an efficient method for the purification of oligodendrocytes and production of oligodendrocyte-conditioned medium that can be used for co-culture experiments.

Generation von Oligodendrozyten und Oligodendrozyten-Konditionierten Mediums für Co-Kultur-Experimente

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

Einzelzell-Elektroporation über verschiedene organotypische Slice-Kulturen von Hippocampus-Exzitatorischen und klassenspezifischen inhibitorischen Neuronen der Maus

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...