Dieses murine extrahepatische Gallengang-Organoidsystem kann den begrenzten Zugang zu präklinischen Cholangiopathienmodellen und die Grenzen von pluripotenten Stammzell- und Leber-abgeleiteten Cholangiocyten-Organoidmodellen adressieren. Unser Modell ist erwachsenengewebespezifisch, reduktionistisch, reproduzierbar und zeit- und kosteneffizient. Es wird für Laboratorien von besonderem Nutzen sein, die keinen Zugang zu menschlichen Geweben haben.
Unsere Technik ermöglicht die Kultivierung einer nahezu unbegrenzten Anzahl von extrahepatischen Gallengangscholangiozyten, um die Geweberegeneration und Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Demonstriert wird das Verfahren von Junya Shiota, einem Post-Doc aus meinem Labor. Für intrahepatische GallengangIsolierung, legen Sie die erwachsene Maus in eine Supine-Position und öffnen Sie die Bauchhöhle entlang der Mittellinie.
Ziehen Sie die Leber zurück, um auf dem Zwerchfell zu ruhen und verwenden Sie ein Hämostat, um das proximale Zwölffingerdarm sanft zu ziehen, um den gemeinsamen Gallengang direkt unter dem Leberhilum zu offenbaren. Verwenden Sie ein Skalpell, um den extrahepatischen Gallengang von den umgebenden Geweben zu trennen. Halten Sie das proximale Ende des gemeinsamen Gallengangs mit Zangen, sezieren Sie den Kanal distal direkt über seinem Punkt mit dem Zwölffingerdarm, bevor das proximale Ende des Kanals aus der Leber seziert wird.
Den isolierten extrahepatischen Gallengang sofort in eine Glasplatte mit Kaltwaschpuffer auf Eis legen, dann den Gallengang aus dem umgebenden Gewebe reinigen und in 0,5-Millimeter-Abschnitte zerkleinern. Wenn das gesamte Gewebe gehackt wurde, übertragen Sie die Abschnitte in ein Rohr mit 500 Mikroliter Dissoziationspuffer für eine 20-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Neutralisieren Sie am Ende der Dissoziation den Puffer mit 500 Mikrolitere eiskaltem Zellkulturmedium und trituieren Sie die Gewebesuspension 20 Mal durch eine 18-Spur-Nadel und dann 20-mal durch eine 20-Spur-Nadel.
Filtern Sie dann die resultierende Zellsuspension durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Rohr. Um eine gallenförmige Organoidkultur zu etablieren, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter eiskalten, sterilen PBS wieder auf und übertragen Sie die Zellen für eine zweite Zentrifugation in ein 1,5-Milliliter-Rohr.
Setzen Sie das gewaschene Pellet in 120 Mikrolitervergoldung, eiskalte Kellermatrix und Platte 40 Mikroliter Zellen in die Mitte von drei Brunnen einer 37 Grad Celsius erwärmten, 24-Well-Platte, dann legen Sie die Platte in einem 37 Grad Celsius Gewebekultur-Inkubator für etwa 15 Minuten. Wenn die Kellermatrix erstarrt ist, fügen Sie 600 Mikroliter 37 Grad Celsius Saatmedium zu jedem Brunnen hinzu, bevor Sie die Platte zum Inkubator zurückgeben. Ersetzen Sie nach drei Tagen und danach alle drei Tage das Aussaatmedium durch 600 Mikroliter frisches organoides Kulturmedium und überwachen Sie das Organoidwachstum regelmäßig mit einem invertierten Mikroskop.
Um die extrahepatischen Gallengangskulturen zu durchdringen, pipette die Organoide in jedem Brunnen mit 400 Mikrolitere eiskaltem PBS 10 mal pro Brunnen, bevor der Brunneninhalt in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren übertragen wird. Durcheine jede Mischung viermal durch eine 25-Spur-Nadel, um die Organoide zu dissoziieren und die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Setzen Sie dann die Zellen in der Kellermatrix mit dem entsprechenden Verhältnis für die Neubeschichtung wieder aus.
Für eine langfristige extrahepatische Gallengang-Organoidlagerung, waschen Sie jeden Brunnen von Organoiden mit Raumtemperatur PBS, ohne die KellermatrixTropfen zu stören und fügen Sie 500 Mikroliter eiskaltes Gefriermedium zu jedem Brunnen hinzu. Die Organoide vorsichtig wieder aufhängen und die Mischung in einzelne kryogene Fläschchen übertragen, dann die Fläschchen 48 Stunden lang bei minus 80 Grad Celsius platzieren, bevor die Organoide zur Langzeitlagerung in einer Dampfphase in einen Stickstofftank übertragen werden. Um die Organoide für die Paraffineinbettung vorzubereiten, ersetzen Sie das Medium durch 500 Mikroliter vier Grad Celsius PBS und übertragen Sie die Suspension von jedem Brunnen in einzelne 1,5-Milliliter-Röhren mit verflüssigter Kellermatrix.
Sammeln Sie die Organoide durch Zentrifugation und verwenden Sie eine modifizierte P1000 Pipettenspitze, um die Überräube sorgfältig zu entfernen, ohne die Pellets zu stören. Dann fügen Sie einen Milliliter eiskalte, 4%Paraformaldehyd zu den Organoiden für eine nächtliche Inkubation bei vier Grad Celsius. Am nächsten Morgen die Fixierung durch einen Milliliter Raumtemperatur PBS für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur ersetzen und die Organoide dreimal durch Zentrifugation waschen.
Nach der letzten Wäsche die Organoide in einem Milliliter 30% Ethanol für eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur wieder aufsetzen, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation in einem Milliliter 70% Ethanol bei Raumtemperatur. Am Ende der 70%ethanol Inkubation die Organoide durch Zentrifugation sammeln und die Organoide in einem Milliliter 100% Ethanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur wieder aussetzen. Am Ende der 100%ethanol Inkubation, Wärme Probe Verarbeitung Gel in einer Mikrowelle für 20 Sekunden oder bis verflüssigt, und fügen Sie 50 Mikroliter des Liquifizierten Gelzuleines zu jeder Röhre von Organoiden.
Legen Sie die Röhren auf Eis, bis das Probenverarbeitungsgel erstarrt ist, und übertragen Sie den Tropfen der Organoide von jedem Rohr auf die blauen Schwammpolster in einer Kassette zur Weiterverarbeitung im Paraffin-Einbau. Legen Sie die Kassette in einen 15 Minuten pro Schritt programmierten Gewebeprozessor und abschnitten Sie dann die paraffineingebetteten Organoide in Probenverarbeitungsgel mit vier Mikrometern pro Abschnitt für immunhistochemische Färbung und Analyse nach Standardprotokollen. Extrahepatische Gallengang organoide Beschichtung Effizienz ist etwa 2%, wenn von neonatalen oder erwachsenen Mäusen isoliert.
Nach Durchgang zwei erhöht sich die Beschichtungseffizienz von extrahepatischen Gallengangsorganoiden, die von erwachsenen Mäusen abgeleitet wurden, auf 11% und bleibt stabil. Die Mehrheit der Organoide zeigt eine zystische Morphologie in allen Passagen mit seltenen unregelmäßigen Organoiden. Die Organoide erreichen einen Wachstumsgipfel von fünf bis sieben Tagen, danach beginnen sie, sich intraluminale Ablagerungen anzusammeln und verschlechtern sich.
Daher sollten die Organoide zur Aufrechterhaltung der Organoidkultur alle sieben bis zehn Tage geteilt werden. Bei der Analyse mit Immunfluoreszenz bestehen extrahepatische Gallenkanal-Organoide aus einer reinen Population von Epithelzellen, die durch E-Cadherin gekennzeichnet sind. Organoide Zellen zeigen auch Marker von Gallenvorläuferzellen sowie Marker der Gallendifferenzierung.
Wichtig ist, dass ein hoher Prozentsatz organoider Zellen ein primäres Cilium besitzt, das durch acetyliertes Alpha Tubulin gekennzeichnet ist, was ein Merkmal normaler Cholangiocyten ist und eine geeignete organoide Zellpolarisation nahelegt. Eine enge Einhaltung des beschriebenen Temperaturzustandes ist erforderlich. Eine sorgfältige Gallengangssektion verhindert eine Kontamination der Bauchspeicheldrüsenzellen.
Der Verlust von zellulärem Material kann durch sorgfältige Manipulation nach zentrifugieren vermieden werden. Diese Organoide können als präklinische Modelle verwendet werden, genetisch und pharmakologisch manipuliert, oder verwendet werden, um Medikamente und die Auswirkungen von Infektionserregern zu testen. Diese Methode kann von Laboren verwendet werden, die genetisch veränderte Mausmodelle nutzen möchten, um die Mechanismen der Cholangiozytenbiologie weiter zu untersuchen.
