Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll zeigt, wie die enzymatische Aktivität von RING-Typ E3-Ubiquitinligasen sowohl in vitro als auch in planta durch einen standortgesteuerten Mutagenese-Ansatz erkannt und funktional charakterisiert werden kann. Durch die Einführung einer Mutation in einer RING-Domäne durch ortsgesteuerte Mutagenese kann der resultierende E3-mangelhafte Mutant parallel zum Wildtypprotein getestet werden, um die enzymatische Aktivität mit der Funktionalität zu verknüpfen. Die Erdeutlichung der biochemischen und mechanischen Grundlagen von RING-Typ E3 Ubiquitin Ligasen kann wesentlich zu unserem Verständnis ihrer biologischen Bedeutung in der Entwicklung, Stresssignalisierung und Wartung der Homöostase beitragen.
Mit geringfügiger Modifikation des In-vivo-Expressionssystems kann dieses Protokoll unabhängig von seinem Ursprung auf die Analyse jeder RING-Typ E3-Ligase angewendet werden. Beginnen Sie mit der Identifizierung der konservierten Cys und Seiner Aminosäuren in der RING-Domäne und dem Entwerfen von Primern, die das Substitutionscodon von Interesse tragen, flankiert von 15 Basenpaaren auf beiden Seiten der Mutationsstelle. Es ist wichtig, die RING-Domäne richtig zu identifizieren, insbesondere ihr konserviertes Cystein und Histidinrückstände.
Online-Tools wie PROSITE können dazu verwendet werden. Verwenden Sie die mutagenen Primer in der PCR-Verstärkung, um die gewünschte Mutation in das Plasmid einzuführen, das das Gen von Interesse beherbergt, und stellen Sie sicher, dass eine hochtreue DNA-Polymerase wie Pfu verwendet wird. Nach pcR verdauen Sie die e.coli-abgeleitete elterliche und halbmethylierte DNA, indem Sie drei Mikroliter dpnl-Restriktionsenzym direkt zur PCR-Reaktion hinzufügen und sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Reinigen Sie die mutagenisierten Plasmide mit einem kommerziellen DNA-Extraktionskit und löschen Sie die DNA in 50 Mikroliter Wasser. Dann transformieren Sie die chemisch kompetenten DH5-alpha E.coli-Zellen mit 0,5 Mikrolitern der wiedergewonnenen mutagenisierten Plasmid-DNA gemäß dem Herstellerprotokoll. Klonen Sie den Wildtyp RING und mutierte RING-Gene von Interesse in den pMAL-c2-Vektor, um diese Gene mit dem MBP-Epitop-Tag zu verschmelzen.
Richten Sie dann die In-vitro-Ubiquitinationsreaktion in einem Gesamtvolumen von 30 Mikrolitern ein, wie im Manuskript beschrieben, und inkubieren Sie die Mischung bei 30 Grad Celsius für zwei Stunden. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie die Probe mit 7,5 Mikroliter5x SDS-PAGE-Ladepuffer mischen und fünf Minuten kochen, und trennen Sie dann die Proteine mit 7,5%SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Übertragen Sie auf die PVDF-Membran und erkennen Sie die Ubiquitination mit Western Blotting und Anti-FLAG.
Färben Sie die Membran mit Coomassie blue, um die gleiche Belastung des getesteten MBP-RING-Proteins zu überprüfen. Streifen Sie die Agrobacterium tumefaciens Stämme, die das epitopgetaggte Gen von Interesse auf LB Medium tragen, das die entsprechenden Selektionsantibiotika enthält. Nach zwei Tagen Wachstum bei 28 Grad Celsius, wählen Sie einzelne Kolonien, und wachsen sie in LB flüssiges Medium mit Antibiotika bei 28 Grad Celsius und 250 Rpm für weitere 24 Stunden.
100 Mikroliter agrobakterielle Kultur mit Antibiotika auf drei Milliliter frisches LB übertragen und die Kultur zusätzlich vier bis sechs Stunden bebrüten. Drehen Sie die Zellen bei 1,800 mal g für sechs Minuten, entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit drei Milliliter Waschpuffer wieder auf. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal, setzen Sie dann die Zellen im Induktionspuffer wieder auf und inkubieren Sie sie für weitere 10 bis 12 Stunden bei 28 Grad Celsius.
Zentrifugieren Sie die Zellen nach der Inkubation sechs Minuten lang bei 1.800 mal g und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie die Zellen mit zwei Millilitern Infiltrationspuffer wieder auf und bestimmen Sie die Konzentration von Bakterien anhand des OD600-Wertes. Agroinfiltrate vier Wochen alte Nicotiana benthamiana Blätter, indem sie sanft mit einer Nadel stechen, und von Hand injizieren Agrobacterium mit einer Spritze, dann umkreisen Sie den infiltrierten Bereich mit einem Marker.
Nach 36 Stunden das infiltrierte Blattgewebe sammeln und zu einem feinen Pulver mit flüssigem Stickstoff mahlen. Setzen Sie das Gewebepulver mit 300 Mikrolitern Proteinextraktionspuffer wieder auf und zentrifugieren Sie es bei 15.000 mal g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Rohr, fügen Sie 5x SDS-PAGE Ladepuffer zu einer Endkonzentration von 1x hinzu und kochen Sie die Probe fünf Minuten lang.
Führen Sie dann eine Western-Blot-Analyse durch, um die In-Planta-Ubiquitination zu erkennen. Streichen Sie die entsprechenden Agrobacterium tumefaciens Stämme mit markierten Genen von Interesse oder leeren Vektor, und injizieren Sie das Agrobacterium auf Nicotiana benthamiana Blätter, wie zuvor beschrieben. Für den E3-abhängigen Substrat-Proteinabbau folgen Sie dem zuvor beschriebenen Protokoll und führen Sie westliches Blotting mit geeigneten Antikörpern durch, um die Proteinakkumulation in Pflanzenzellen zu erkennen.
Für E3-abhängige überempfindliche Reaktions-vermittelte Zelltodhemmung, überwachen Sie die agroinfiltrierten Blätter für Zelltodsymptome zwei bis vier Tage nach der Infiltration. Ein typisches In-vitro-Ubiquitinationstest-Ergebnis enthält einen Multiband-Abstrich, der mit dem Molekulargewicht des getesteten Proteins beginnt und nach oben schreitet. Wie erwartet, negativsteuerte einzelne Komponenten oder die Verwendung von MBP zeigten das verschmierte Signal nicht.
Darüber hinaus zeigte die Coomassie-Blaufärbung der PVDF-Membran in allen Steuerungen die gleiche Belastung von MBP-RHA1B oder MBP. 11 verschiedene E2 wurden getestet, um zu untersuchen, wie die In-vitro-Ubiquitination je nach spezifischer E2-E3-Kombination variiert. Die nachgewiesene Ubiquitinationsaktivität reichte von keinem Signal bis zu einem Multibandabstrich, der bei unterschiedlichen Molekulargewichten begann, was auf unterschiedliche Ubiquitinationsmuster hindeutet.
Die RING- und K-mutierten Versionen von RHA1B wurden auf Ubiquitination in vitro und in Planta getestet. Der Mangel an enzymatischer Aktivität der RING-mutant Version wird durch seine Unfähigkeit unterstützt, entweder einen Mehrbandabstrich in vitro zu erzeugen oder Poly-Ubiquitinationssignal in Planta zu fördern. Obwohl für die K-Mutation ein marginales Selbstallgegenwärtigationssignal in vitro nachgewiesen wurde, wurde in Planta nur eine Hintergrundubiquitination nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass der K146-Rückstand auch für die E3-Aktivität unerlässlich ist.
Im Gegensatz zum Wildtyp RHA1B störte der RING-Mutant ohne E3-Ligaseaktivität nicht den tod von überempfindlichen Reaktionszellen. Western Blotting bestätigte, dass sich der Gpa2 nicht in Gegenwart von RhA1B am Wildtyp ansammelte, aber der RING-Mutant hatte keinen Einfluss auf die Proteinstabilität. Da für die Ubiquitinationsreaktion eine richtige E2-E3-Kombination erforderlich ist, sollten In-vitro-Ubiquitinationstests parallel zu mehreren E2-Enzymen durchgeführt werden, die verschiedene E2-Klassen darstellen, um falsche negative Ergebnisse zu vermeiden.
Ein E3-Ligase-Mangel-Mutant erleichtert die Prüfung von Enzym-Substrat-Wechselwirkungen in vivo. Darüber hinaus verleiht diese Mutante oft einen dominanten negativen Phänotyp, der in funktionellen Knockout-Studien als alternativer Ansatz zu RNAi verwendet werden kann. Mit diesem Protokoll, Es wurde vor kurzem festgestellt, dass RHA1B Nematoden-Effektor stören mit Pflanzenimmunsignalisierung in einer E3-abhängigen Weise durch die Zielscheibe der Pflanze Gpa2 Immunrezeptor für Ubiquitination und Abbau.
