Dieses Protokoll kann durch den Einsatz der Polybubble zur Erhaltung der Ladungsstabilität beitragen, die sowohl kleine Moleküle als auch Proteine sein kann, was wiederum die Kohlenstoffwechselwirkungen mit dem Lösungsmittel reduzieren kann. Diese neuartige Technik kann eingesetzt werden, um die Impfabdeckung in den Entwicklungsländern zu verbessern, da die Impfstofffunktionalitäten aufgrund ineffizienter Transport- und Lagereinrichtungen häufig beeinträchtigt werden können. Um die Polybubbles herzustellen, verwenden Sie zunächst eine Ein-Milliliter-Transferpipette, um 800 Mikroliter 10%CMC in eine 0,92 Milliliter Glasflasche zu geben.
Um PCLTA zu synthetisieren, mischen Sie 1 000 Gramm pro Milliliter 14 Kilodalton PCL in 200 Mikroliter DCM. Um PLGADA zu synthetisieren, mischen Sie 1 000 Gramm pro Milliliter von fünf Kilodalton PLGADA in 200 Mikroliter Chloroform. Photoinitiator mit dem polymeren Gemisch von Interesse im Verhältnis 0,005 zu 1 mischen und 200 Mikroliter der resultierenden Lösung in eine Ein-Milliliter-Glasspritze laden, die auf einer Spritzenpumpe montiert ist, die mit einem Dosier-Edelstahlrohr mit einem Innendurchmesser von 0,016 Zoll verbunden ist.
Mit einem Mikromotor, um die Vorwärts- und Rückwärtsbewegung des Polymerrohres zu steuern, das Polymer in die 10%CMC in die Glasdurchstechflasche zu injizieren, um die Polybubbles zu bilden und die Polybubbles unter ultraviolettem Licht bei einer Wellenlänge von 254 Nanometern für 60 Sekunden bei zwei Watt pro Quadratzentimeter zu aushärten, dann die Polybubbles in flüssigem Stickstoff für 30 Sekunden einfrieren und die Träger über Nacht bei 0,01 Millibar Minus graduieren. Für die Zentrierung der Ladung von Interesse innerhalb einer Polybubble, mischen Sie die Ladung mit 5%CMC in einem Rotator über Nacht, um die Viskosität der Ladung zu erhöhen, bevor sie manuell zwei Mikroliter des Ladungsgemisches in die Polybubble injizieren. Wenn die gesamte Ladung injiziert wurde, re-cure, Flash Freeze, und lyophilisieren die injizierte Polybubble, wie gerade gezeigt.
Verwenden Sie am nächsten Morgen Zangen, um die Polybubble vom getrockneten CMC zu trennen und die Polybubble mit entionisiertem Wasser zu waschen, um restliche CMC zu entfernen. Dann schneiden Sie die Polybubble in die Hälfte und bilden die Hälften durch konfokale Mikroskopie, um sicherzustellen, dass die Ladung zentriert ist. Für die Freisetzung kleiner Moleküle können Sie die Polybubbleen mit zentriertem Acriflavine in 400 Mikroliter PBS bei 37 Grad Celsius für die entsprechende Inkubationslänge inkubieren.
Zu jedem versuchsweise Zeitpunkt den Überstand sammeln und 400 Mikroliter frisches PBS in die Durchstechflasche geben. Verwenden Sie dann einen Plattenleser, um die Fluoreszenzintensität des gesammelten Überstandes zu quantifizieren. Mischen Sie für die Nahinfrarotaktivierung die Polymerlösung mit hydrophobisierten Gold-Nanostäben im Verhältnis eins bis neun und fügen Sie den Fotoinitiator mit einem Verhältnis von 0,005 zu 1 hinzu.
Injizieren Sie die resultierende Mischung in eine 0,92 Milliliter Glasdurchstechflasche mit 800 Mikroliter10%CMC und härten Sie die Polybubbleen unter ultraviolettem Licht aus, wie gezeigt. Nach Blitzeinfrieren und Lyophilisierung, wie gezeigt, waschen Sie die Polybubbles mit entionisiertem Wasser und inkubieren Sie die Träger in 400 Mikroliter PBS bei 37 Grad Celsius für die entsprechende Inkubationszeit. Am Ende der Inkubation erhalten Sie ein vorausschauendes Infrarotbild der Polybubble vor und nach der Aktivierung der Polybubbles mit einem 801 Nanometer Nahinfrarotlaser bei acht Ampere für fünf Minuten dreimal pro Woche für vier Wochen für PLGADA Polybubbles und 14 Wochen für PCL-PCLTA Polybubbles.
Zu jedem versuchsweise Zeitpunkt den Überstand sammeln und 400 Mikroliter frisches PBS in die Durchstechflasche geben. Berechnen Sie dann die Temperaturunterschiede zwischen den Polyblasen vor und nach der Laseraktivierung basierend auf den Temperaturwerten aus den vorausschauenden Infrarotbildern. Die Zugabe von 10%CMC-basierter wässriger Lösung führt zu einer kompletten Polybubble Suspension für eine erfolgreiche Aufrechterhaltung der Polybubble Sphärizität.
Die Einspritzung von Ladung in die Polybubble in Abwesenheit von CMC führt zu Leckagen und einem daraus resultierenden Mangel an Ladungsretention innerhalb der Polybubble. Um diese Leckage zu beheben, kann die Viskosität des PCLTA mit Kaliumcarbonat isoliert nach Derendverschluss Polycaprolacton mit Triacrylat erhöht werden und die Viskosität der Ladung kann durch Mischen der Ladung mit 5%CMC erhöht werden. Die Viskosität der PLGADA Polybubbles reicht aus, um die Zentrierung der Ladung zu erleichtern und erfordert keine Modulation über Kaliumcarbonat.
Beachten Sie, dass nach dem Mischen von HIV gp120/41 Antigen mit und ohne Trehalose vor der Polybubble-Injektion kein statistisch signifikanter Unterschied in der Bindungseffizienz des Antikörpers beobachtet wird. Verzögerte Burst-Freisetzungen werden in PLGADA-Polybubbleen mit Acriflavine in der Mitte des 19. Tages für Polybubbleen beobachtet, die bei 37 Grad Celsius und am fünften Tag für Polybubbleen bei 50 Grad Celsius inkubiert werden. Darüber hinaus können PLGADA Polybubbles und PCL- und PCLTA-Polybubbles, die Gold-Nanostäbe enthalten, mehrfach erfolgreich laseraktiviert werden.
Achten Sie bei der Bildung der Polybubbles darauf, die Reagenzien vor dem Licht zu schützen und die Lösungen sofort zu verwenden. Nach der Entwicklung dieser Technologie wollten wir auch die Automatisierung dieses Prozesses auf die Skalierung der Polybubble-Produktion untersuchen.
