The authors would like to acknowledge the NHMRC for career development award and grant support APP1066336 which supported this work.

1. Vorbereitung der Kultur, Medien und Gerichte <ol><li> Make 200 ml Biggers Whitten und Whitten (BWW) 17 Arbeitslösung durch Zugabe von 5,54 g NaCl, 0,356 g KCl, 0,25 g CaCl 2, 0,162 g H 2 KO 4 P und 0,294 g MgSO 4 zu 1 l Milli-Q-Wasser . Dies ist der Stammlösung und kann bei 4 ° C für bis zu einem Monat aufbewahrt werden. </li><li> Aus der Stammlösung hinzufügen 420 mg NaHCO 3 -, 200 mg Glucose, 6 mg Natriumpyruvat, 600 mg Rinderserumalbumin, 0,74 ml Natriumlactat und 4,0 ml HEPES-Puffer auf 193 ml der BWW Lager. Dies ist der Arbeitslösung und wird immer frisch am Tag hergestellt und vor der Verwendung auf 37 ° C äquilibriert. </li><li> Um die Kanüle zu machen, nehmen Polyethylen (PE) Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,4 mm und einem Außendurchmesser von 1,1 mm und halten geringer Hitze (typischerweise Methanol Flamme), so daß der Schlauch zu schmelzen beginnt. Den Schlauch sofort OutW ziehenard zu strecken und machen den Außendurchmesser enger. </li><li> Geschnitten, um eine Verengung der ein Ende, das für eine einfachere Kanülierung des Vas deferens ermöglicht herzustellen. </li><li> Schneiden des anderen Endes der Kanüle auf etwa 15 cm. Legen Sie eine 30 G Nadel in dem stumpfen Ende und befestigen Sie eine 3-ml-Spritze, um sie (ganz eingefahren). </li><li> Machen Sie eine Saugmundstück durch Schneiden einer 20 cm Länge der PE-Schlauch (4,2 mm Innendurchmesser, 6,4 mm Außendurchmesser). Legen Sie ein Mundstück in ein Ende. </li><li> Setzen Sie den Mikro Glaskapillare Halter und den Glas Mikrokapillare selbst (typischerweise 3 &amp; mgr; l für eine Maus 40 ul für eine Ratte). </li></ol> 2. Entfernung von Nebenhoden von Maus <ol><li> Euthanize Mäusen nach IACUC zugelassene jedem Organ Verfahren. </li><li> Nehmen Sie die Tier- und machen einen kleinen Schnitt in den Hodensack, die Nebenhoden aussetzen. Ziehen Sie die Hoden und Nebenhoden aus dem Hohlraum mit einem Paar Uhrmacher # 5 Pinzette. </li><li> Schneiden der Samenleiter, so dass wenigstens 1-2 cm bleiben der Cauda epididymis befestigt. Darüber hinaus schneiden die proximalen Ausführungsgänge und Gewebe Anschluss der Nebenhoden in die Hoden und nehmen Sie das gesamte männliche Fortpflanzungsspur. </li><li> Legen Sie die gesamte männliche Fortpflanzungsspur unter einem Binokular mit einem Vergrößerungsbereich in der Reihenfolge der 5-40X. </li></ol> 3. Kanülieren des Nebenhoden <ol><li> Band entlang der Kanüle zum Mikroskop, so dass 1-2 cm von der Einschnürung (kegelförmigen) Ende frei ist und durch die Linse sichtbar. </li><li> Nehmen Sie ein Paar Uhrmacher # 5 Pinzette und sanft umklammern jede Seite der Samenleiter und der Samenleiter zu ziehen auf die Kanüle, so dass die Kanüle in der Samenleiter geht. </li><li> Nehmen Sie eine Länge von nicht-resorbierbaren geflochtenen schwarzen behandelt Seide (Größe 5-0) und einen Knoten um die Kanüle eingeführt Samenleiter. Stellen Sie sicher, der Knoten ist eng gezogen, um die Kanüle in den Samenleiter zu halten, wenn Luftdruck from die Spritze angewendet wird. </li></ol> 4. Retrograde oder Rückspülung von Caudal Nebenhoden Spermatozoen <ol><li> Mit Uhrmacher # 5 Zange greifen das distale Ende der cauda Nebenhoden und entfernen Sie die Tunica albuginea, um eine einzelne Nebenhoden Röhrchen aus. </li><li> Mit der Zange, ziehen Sie die Röhrchen aus, um freizulegen und dann zu necken auseinander, um eine Öffnung zu schaffen für die Spermien freigegeben werden. </li><li> Drücken Sie vorsichtig auf die 3 ml (Maus) oder 20 ml (rat) Spritze, um Luft aus der Spritze in den Samenleiter zu vertreiben. Bei entsprechenden Druck- wird Spermatozoen beginnt langsam aus dem zerbrochenen Röhrchens am distalen Ende der Cauda epididymis kommen. Zu diesem Zeitpunkt wird unter Absaugen des Mundstücks, um die Spermien in der Glaskapillare ziehen. Anmerkung: In der Regel in einer Maus, kann 2-3 ul von Spermatozoen in Abhängigkeit von dem Alter des Tieres erhalten werden. Eine Ratte Willen, am Durchschnittsertrag von 30 bis 40 &amp; mgr; l. </li></ol> 5. Waschenund Lyse der Spermatozoen in Vorbereitung für Proteomics <ol><li> Vertreibt die Spermien von der Glaskapillare in 1 ml-Lösung von BWW-Lösung (37 ° C) durch sanft weht in das Mundstück oder Anbringen einer Spritze und Ausstoßen von Luft, um die Spermien wieder aus der kapillaren schieben. </li><li> Sobald die Samenzellen diffundiert, waschen 3x (300 × g, 5 min) mit 1 ml BWW um kontaminierende Proteine ​​zu entfernen. Nach dem letzten Waschen, entfernen Sie den Überstand. Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt können die Spermien für eine spätere Verwendung eingefroren werden. </li><li> Solubilisierung von Proteinen unter Verwendung von 4% CHAPS, 2 M Thioharnstoff, und 50 mM Tris, pH 7,4 für 1 h mit intermittierendem Vortexen. </li><li> Nach Lyse der Zellen, Zentrifuge (10.000 × g, 20 min), nehmen Sie Standes und Überführung in ein neues Röhrchen. Anmerkung: An diesem Punkt kann die Proteinquantifizierung durchgeführt werden. </li></ol> 6. Disulfidbrücke Reduktion und Alkylierung <ol><li> Als Endkonzentration hinzufügen 10 mM DTT zu lysierenden Proteine, vortex und Inkubation bei RT für 30 min. </li><li> Idodoacetamide als Endkonzentration Lysat Vortex 50 mM und Inkubation bei RT für 30 min im Dunkeln. </li></ol> 7. Niederschlag <ol><li> Methanol Chloroform auszufällen die Probe durch Zugabe von 1 Volumen-Lysat (400 &amp; mgr; als ein Beispiel), fügen ein Volumen (400 ul) Methanol und 0,5 Volumen (200 ul) Chloroform. </li><li> Vortex die Probe und Spin (10.000 × g, 2 min). </li><li> Beachten Sie, dass zwei Phasen wird nach der Zentrifugation angezeigt. Entsorgen Sie alle aber 2 mm von der Deckschicht (darauf achten, daß die Schnittstelle zu stören). </li><li> 1 Volumen (400 ul) Methanol, vorsichtig invertieren 1-2x Rohr zu mischen und wieder drehen (10.000 × g, 15 min). Überstand verwerfen zu verlieren und an der Luft trocknen Pellet für 3-4 min. </li></ol> 8. Trypsinverdau <ol><li> Rekonstituieren Trypsin in 25 mM Ammoniumbicarbonat, enthaltend 1 M Harnstoff in einem Verhältnis von 50: 1 (W / W; Protein: Trypsin) und inkubiert Overnight bei 37 ° C, vorzugsweise bei 700 rpm auf einem Thermomixer. </li><li> Spin (10.000 × g, 15 min), um unverdaute Material zu pelletieren. Überstand in neues Röhrchen. </li></ol> 9. Phosphopeptidanreicherung <ol><li> Führen Reinigung und Anreicherung von Phosphopeptiden aus dem tryptischen Verdaus, wie zuvor beschrieben 18. Verdünne tryptischen Peptide 10-fach in DHB-Puffer [DHB Puffer besteht aus: 350 mg / ml 2,5 dihydrobenzesulfonic Säure (DHB), 80% (v / v) ACN (Acetonitril), 2% (v / v) TFA (Trifluoressigsäure Säure)] und auf Trocken TiO 2 Perlen (200 ug). </li><li> Lassen Sie auf einem Schüttler bei Raumtemperatur für 1 Std. </li><li> Die Probe mit DHB-Puffer waschen, drehen und entfernen Überstand. Dann waschen Sie die Probe dreimal mit Waschpuffer [80% ACN (V / V), 2% TFA (v / v)], um den DHB entfernen. </li><li> Nach dem letzten Schleudern unmittelbar eluieren Phosphopeptide mit Elutionspuffer durch Zugabe von 25 ul einer 2,5% Ammoniumhydroxid, pH ≥ 10,5 Lösung. SStift und Überstand. Sofort mit ~ 0,3 ul Ameisensäure zu neutralisieren. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die entscheidenden Schritte für eine erfolgreiche und reproduzierbare Proteomanalyse von Spermatozoen sind: 1) die Reinheit des Ausgangsmaterials; 2) Entfernung von unerwünschten Salzen und Detergenzien; 3) Denaturieren Proteinen in vollem Umfang um zu ermöglichen, Trypsin, eine hohe Ausbeute der Proteine ​​zu verdauen, und 4) die Probenhandhabung zu minimieren, um den Verlust von Peptid zu reduzieren. Um die Cauda Nebenhoden erfolgreich rückmelden, ist es wichtig, den Bereich, aus dem der Spermien wird verlassen zu lokalisieren. Im Fall von Ratte und Maus, ist dies an dem Scheitel der konkaven Fläche, in der Mitte des kaudalen Bereich des Nebenhodens (siehe 2A). Wenn man weiter in Richtung auf den Vas deferens geht, ist Rückspülen erleichtert und die Erfolgsrate in der Regel höher. Allerdings geht dies zu dem Verlust der Spermienzahlen. Alternativ, wenn man versucht, auf den Korpus zu bewegen weiter proximal, dann ist die Menge an Druck erforderlich, um die Spermien durch den epididym zurückzudrängenal Kanäle oft so hoch, dass eine Beschädigung der Epididymis unweigerlich auftritt. Rückspülen der Epididymis ist traditionell unter Verwendung von mit Wasser gesättigten Mineralöl und eine ausgeglichene Salzlösung in der Spritze selbst als ein Medium, um die Spermatozoen 22-25 entfernen. Beide Verfahren sind potenziell problematische der LC-MS. Erstens ist Mineral wahrscheinlich die Nano-C18 Nano-Säulen, die im Grunde weltweit für Proteomanalyse und Pflege verwendet werden, müssen getroffen werden, damit keiner vorne in das Verfahren durchgeführt zu blockieren. Wenn dies auftritt, ist es unmöglich, weiter, und die Probe wird im wesentlichen verloren. Dies kann durch die Verwendung von BWW oder andere ausgeglichene Salzlösungen in der Spritze jedoch überwunden werden, auch wenn dies erfolgreich ist, wir bald erkannt, dass viele der Spermatozoen sich beweglich, sobald der BWW-Lösung in Kontakt kam, und der Schwanz epididymalen vermischt Zellen. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir rückmelden Sie einfach die Spermien mit Luft. Nicht nur ist die Qualkeit von Spermatozoen vergleichbar mit der flüssig-basierten Methoden, aber die Menge ist identisch. Phosphoproteomik ist vielleicht eine der wenigen Möglichkeiten, um festzustellen, welche Signalwege sind an Spermien nach der Ejakulation auftreten. Einer der Hauptwege wir untersuchen ist der Prozess der Kapazitation. Spermatozoen unterziehen müssen &quot;Kapazitation&quot;, bevor sie in der Lage zur Bindung an ein Ei ist. In der Praxis wird dies im wesentlichen durch Inkubieren Spermatozoen für einen Zeitraum erreicht (; Ratte 1,5 h; Maus 40 min menschlichen 3-24 h) in BWW-Lösung mit Serumalbumin. Zuvor haben wir und andere eine Rolle für mehrere Kinasen in Kapazitation beteiligt gezeigt. Von Interesse, Deletion des PKA μ II herzustellen Mäusen, deren Spermien schwimmen in vitro spontan, können aber nicht die Hyperaktivierung 26 zu unterziehen. Letzteres ist ein Markenzeichen der Kapazitation, wobei Spermien verändern ihre Schwimmmuster von hoher Geschwindigkeit und niedriger Amplitude, auf einen niedrigenGeschwindigkeit, schlagen hohe Amplitude Frequenz. Wir haben gezeigt, Downstream-Kinasen an diesem Prozess beteiligt sind pp60-Börsenaufsicht (SRC) 13,27 c-ja 28 und c-ABL-14. Interessanterweise Hemmung des SRC stoppt Kapazitation abhängigen Tyrosinphosphorylierung 13. Dies kann jedoch mit Okadainsäure überwunden werden, was darauf hindeutet, dass SRC wird nicht direkt in der allgemeinen Einsetzen der Tyrosinphosphorylierung 29 beteiligt ist, sondern kann eine Phosphatase 29 regulieren. Das Problem bei der Verwendung BWW als Medium, um Spermien aus dem Nebenhoden zu zwingen ist, dass einmal aktiviert, Maus Spermien erst ca. 40 min zu befähigen. Da die Isolation von Spermatozoen 5 min / Maus und oft mehrere Mäuse werden in einem Experiment verwendet, so will Spermatozoen zu verschiedenen Reifestadien zu Beginn des Experiments. Um dies zu überwinden, kann Luftdruck verwendet, um die Spermien aus den Nebenhoden Schwanz in eine Glaskanüle zu drücken. Nicht nur sind die Spermien inactive und im Wesentlichen, wie sie in der Schwanz Milieu gefunden werden, macht es möglich, unbewegliche und bewegliche Phosphoproteomik vergleichen. Probenhandhabung für Phosphoproteomik sollten auf ein Minimum beim Vergleich von Spermien in zwei verschiedenen Funktionszuständen gehalten werden. Die Verwendung von Methanol Chloroform gegenüber anderen traditionellen Methoden der Proteinfällung 1) verringert die Notwendigkeit für zusätzliche Waschschritte, 2) entfernt fast alle Spuren von Salzen und Fetten und 3) eine nachgewiesene Fähigkeit, geringe Häufigkeit Proteine ​​über TCA 19 auszufällen. Proteinfällung vor Trypsinverdau wird empfohlen, da wird nicht nur dazu beitragen, Protein (die Trypsin Verdauung hilft) denaturieren, aber beseitigt viele der in der Zelle vorhandenen MS-inkompatible Metaboliten. Der Vergleich von Spermien Phosphopeptide können in einer Anzahl von Wegen durchgeführt werden. Auf der Grundebene, einen einfachen Vergleich des identifizierten Phosphopeptid in einer Probe, der in einem anderenProbe in dem Verfahren als &quot;spektrale Zählung&quot; bekannt sind, können durchgeführt werden. Aber Kritik an diesem Ansatz im Grunde, weil frühe Proteom-Studien wurden mit niedrigen Wiederholungen gewesen (für eine ausführlichere Diskussion siehe Lundren et al. 30). Eine anspruchsvollere Ansatz ist es, an der Intensität des Peptids Ausgangsmasse schauen und vergleichen Sie dies mit den anderen Proben (markierungsfreie Vergleich). In dem in 4 gezeigten Beispiel kann ein Peptid abwesend vom vom unbeweglichen (Figur 4 oben), sondern in der beweglichen vorhanden (Abbildung 4 unten) Spermatozoen von m / z 650-670 ersichtlich. Dieser Prozess, der als MS-Label kostenlose Quantifizierung bezeichnet eine markierungsfreie Strategie. Eine alternative Strategie häufig verwendet, um den Betrag der Durchläufe für die Proteom-Quantifizierung zu reduzieren ist, um Isotope verwenden. Da die Masse eines Isotops anders ist, kann das Massenspektrometer verwendet, um die Intensitäten des Elut vergleichening Peptiden. Jedoch anders als die meisten anderen Zelltypen, einige Isotopenmarkierung kann nicht an Spermien aufgebracht werden. Zum Beispiel kann die Zugabe von stabilen Isotopen (eines schwereren Isotops wird zu einer Probe zugesetzt, während eine leichtere Version wird zu einer anderen zugegeben) in Gewebekultur verwendet werden. Wenn die Isotope bekommen in das Protein eingebaut, kann eine Proteomanalyse durch die Kombination der beiden Proben (Multiplexing) durchgeführt werden. Jedoch in dem Fall von Spermatozoen, kann dies nicht erfolgen, einfach aufgrund der Tatsache, daß 1) eine Isotopenmarkierung erfordert mehrere Durchgänge (bis zu 8) in der Gewebekultur und 2) die Spermien hat keine Kern-Gens die Transkription und Translation und somit sie nicht die Isotope in alle ihre Protein integrieren können trotzdem. Ein Weg, um dieses ist radioaktiv markiertem Mäuse bestellen, diese sind jedoch extrem teuer. Ein alternativer Ansatz besteht darin, eine chemische Markierung verwenden. Dies wurde gemacht, wenn nicht-kapazitierten Mäuse wurden mit kapazitierten Mäusen verglichen. In diesem Fall ist ein D 0 und ein D <sub&gt; 3 -Marker wurde verwendet, um zwischen einer Probe und einem anderen in dem Massenspektrometer 31 zu unterscheiden. Andere Ansätze können die Verwendung von iTRAQ (iTRAQ), wobei Lysinen chemisch unterschiedlicher Masse Isotopen gehören; iCAT (Isotop codierte Affinitäts-Tag), wobei Cysteine ​​mit unterschiedlichen Massen Isotopen und schwere und leichte Wasser Kennzeichnung versehen. In jedem einzelnen Fall muss allerdings eine Sache, die im Auge behalten werden. Die MS nur berichtet, was in einer Probe vorhanden ist, und das ist ein Spiegelbild der alles, was in diesem Beispiel bis zu diesem Zeitpunkt geschehen ist. Minimierung der Probenhandhabung bei gleichzeitiger Maximierung der Ausbeute bei jedem Schritt ist für eine erfolgreiche Proteomanalyse notwendig.

Nachdem aus dem Hoden entstanden, sind Spermien stark dennoch bemerkenswert unterscheiden, sind diese Zellen unreife 1,2. Als solcher, fehlt ihnen die Funktionalität, einschließlich der Fähigkeit zu schwimmen und zu binden, um eine Eizelle 3. Obwohl weitere Reifung der Samenzelle erforderlich ist, kann dies nicht mittels kanonischer Routen stattfinden, da in diesem Stadium ihrer Zelldifferenzierungsprozesses, unfähig Gentranskription und ferner Proteinbiosynthese 4 sind. Biologische Kompetenz basiert auf Spermien übertragen als sie aus dem Hoden und geben Sie einen Teil der männlichen Geschlechtsorgane als Nebenhoden 5 bekannt. Der Nebenhoden ist ein eng gewickelten, hoch differenzierte Rohr, das die Ausführungsgänge (der Hoden) wird an der Samenleiter und ist in allen männlichen Säugetieren 6 vorhanden. Spermien schrittweise ihre Düngepotential während Nebenhoden Abstieg zu erwerben, die sich auf die sich ständig verändernden Umgebung, die Lumen crvon den lokalen Nebenhoden Epithelzellen 7 eated. Die verschiedenen sekretorischen und wieder aufnahme in der Nebenhoden Milieu Akt gegenwärtigen Aktivitäten der Spermien selbst zu verändern, Änderung seiner Protein-, Kohlenhydrat- und Lipidzusammensetzung 6. Die Bedeutung der Nebenhoden, insbesondere die anfängliche &quot;caput &#39;Bereich dieser Struktur wurde mit chirurgischen Ligationstechniken 8 veranschaulicht. Spermien im Hoden von Ausführungsgang Ligation erhalten fehlen völlig in irgendeiner Eigenschaft, um die Eizelle zu befruchten 9-11. Zusätzlich zu den Nebenhoden Umwelt, um Signalwege innerhalb der Spermien Arbeit posttranslational ändern Sie den vorhandenen Samenzelle ergänzen. Zum Beispiel, Spermien aus den frühen Regionen der Epididymis die unterschiedliche Muster der Protein-Phosphorylierung im Vergleich zu den letztgenannten Regionen 5,12. Dies ist nicht überraschend, da es große Unterschiede in der capability der Spermien aus diesen Regionen. Zum Beispiel Spermien aus dem frühen, caput Nebenhoden sind immotilite. Im Gegensatz dazu werden Samenzellen von der Cauda Region nach vorne durchlaufen progressive Motilität einmal in isotonischen Medium platziert. Da Nebenhoden Samenzellen nicht in der Lage de-novo Proteinbiosynthese sind, müssen alle intrinsischen Weg der Regulierung Spermienfunktion durch post-translationale Modifikationen (PTM) sein. Daher liegt es nahe, dass die Proteomik Vernunft, insbesondere die Untersuchung der PTMs wie Phosphorylierung muss eine große Schubkraft, wenn wir Spermienreifung verstehen. Eine alternative Methode, um Spermien aus den epididymidies erhalten zu bedienen Retro-Rückspülung 13-16. Obwohl diese Technik sicherlich zeitaufwendig und nimmt einen höheren Grad der Geschicklichkeit der Bedienungsperson, erhalten die Spermatozoen Reinheit von über 99,99% zeigen durchweg. Zusätzlich, im Gegensatz zu allen anderen Techniken Spermatozoen can in einem Ruhezustand isoliert werden, wodurch es möglich zu untersuchen, wie die Beweglichkeit der Spermien wird eingeleitet. Als Probenvorbereitung ist der wichtigste Aspekt für die Proteomanalyse, Isolierung der Spermien hat sich zu einer der wichtigsten Aspekte der Spermien-Proteom-Studien. Dieses Protokoll sieht eine Erklärung wie Spermien aus dem Nebenhoden Cauda isoliert. Im Anschluss daran wird die TiO 2 Phosphopeptidanreicherung Verfahren dargelegt, mit spezieller Bezugnahme, wie Peptide, die von den hochdifferenzierten Spermien gewinnen. Die MS-Ansatz kann verwendet werden, um wechselnde Phosphopeptide zu unterscheiden wenn man die Nebenhodenschwanz Spermatozoen in einem Zustand zu vergleichen (unbeweglich oder Nicht kapazitierten) zu einem anderen (beweglich, kapazitierten, Akrosom reagierte, etc.) so dass dies ein leistungsfähiges Konzept für Spermien zu untersuchen Funktion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="687">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,5-dihydroxy-1,4-benzoquinone</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>195464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-D Quantitation Kit</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>80-6483-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Albumin from bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonia Solution 25%</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.05432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate</td>
			<td>Research Organics</td>
			<td>1300C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10077.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">di-sodium hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O6440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamine-L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hepes (free acid)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iodoacetic acid free acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L1750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Res. Org.</td>
			<td>0090M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10158.6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Percoll (sterile)</td>
			<td>VWR (GE Healthcare)</td>
			<td>GEHE17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt</td>
			<td>ThermoFisher Scientific (Pierce)</td>
			<td>PIE78420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Medical Store</td>
			<td>CH 600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3817</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium di-hydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>10247.4V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Ultra Pure Grade</td>
			<td>Amresco (Astral)</td>
			<td>AM0497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin Gold-Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z0173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.4 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30 gauge needle</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">NN2038R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 mL syringe</td>
			<td style="width:175px;">Terumo</td>
			<td style="width:129px;">SS035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4.2 mm polyethylene tubing</td>
			<td style="width:175px;">Goodfellow</td>
			<td style="width:129px;">ET317640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Braided silk (5-0)</td>
			<td style="width:175px;">Dynek</td>
			<td style="width:129px;">CSS0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichloroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>299537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TiO2 beads (from disassembled column)</td>
			<td style="width:175px;">Titansphere</td>
			<td style="width:129px;">6HT68003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eppendorf Tube</td>
			<td style="width:175px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C7B30</td>
			<td style="width:175px;">Sigma</td>
			<td style="width:129px;">C0856</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phosphopeptide analysis of rodent epididymal spermatozoa

Spermien sind ziemlich einzigartig unter den Zelltypen. Obwohl in den Hoden produziert werden beide Kern Gentranskription und Translation augen, wenn der Vorläufer-Knopfzelle beginnt, sich zu verlängern und differenzieren, was morphologisch als Samenzelle erkannt geschaltet. Jedoch ist das Spermium sehr unreif, da sie keine Möglichkeit für die Motilität oder Eiererkennung. Diese beiden Ereignisse auftreten, sobald die Spermien Transit eine sekundäre Organ als Nebenhoden bekannt. Während der ~ 12 Tage Passage, die es dauert, bis eine Samenzelle, durch den Nebenhoden übergeben, post-translationale Modifikationen bestehender Proteine ​​spielen eine zentrale Rolle bei der Reifung der Zelle. Ein wesentlicher Aspekt solcher ist Proteinphosphorylierung. Um Phosphorylierung Ereignisse während Spermienreifung stattfindet zu charakterisieren, müssen sowohl reine Samenzellpopulationen und Pre-Fraktionierung von Phosphopeptiden eingerichtet werden. Mit Rückspülung Techniken, ein Verfahren zur Gewinnung von reinem Spermien of hohe Qualität und Ausbeute der distalen oder Schwanznebenhoden skizziert. Die Schritte zur Solubilisierung, Verdauung und Vorfraktionierung von Spermien Phosphopeptide durch TiO 2 Affinitätschromatographie erläutert. Nachdem sie isoliert wurde, kann Phosphopeptide in ein MS eingespritzt werden, um beide Protein Phosphorylierungsereignissen spezifischen Aminosäurereste während der Spermareifung Prozesse zu identifizieren und zu quantifizieren, die Niveaus der Phosphorylierung stattfindet.

Die Qualität der Ergebnisse von jedem Proteomanalyse ist stark abhängig von dem Ausgangsmaterial. Mit modernen MS werden leichte Verschmutzungen in Probenvorbereitungen leicht nahm. Daher ist es kritisch, im Falle von Spermium Proteomik, die Bereitstellung eines Verfahrens, das hochreine Spermien gibt wählen. Wie in Figur 1 dargestellt ist, wird retrograd Rückspülung verwendet, um Spermien der Cauda epididymis aus abzurufen. Dies beinhaltet Kanülieren der Samenleiter mit PE-Schlauch, der ein bis langsam Luftdruck aus der Spritze befestigt gelten können. 1A zeigt die Cauda Nebenhoden zusammen mit den Samenleiter. 1B ist eine Nahaufnahme, wie die Samenleiter gebunden ist, wo die Kanüle eingesetzt ist. Dabei, so, Spermatozoen im exzidiert Ende eines Röhrchens aus den Schwanzhoden freigesetzt. Wie in 2A gezeigt, werden die Spermien von den Scheitelbereichen der caud extrahiertenein Nebenhoden und werden in eine Glaskapillare in einem Ruhezustand (Figur 2B) angesaugt wird. Dies hat mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen &quot;swim-up&quot; -Verfahren, von denen nicht zuletzt die Möglichkeit, eine Analyse der phoshoproteomic Spermien vor und nach der Aktivierung der Beweglichkeit führen. Die Spermien können dann in Medien seiner Wahl ausgeschlossen werden. 2C (links) zeigt, wie die Spermien sofort kümmern Vertreibung in BWW Medien. Viele der Zellen verklumpten. Es wird jedoch nach 10 Minuten die Kompetenz der Zellen gezeigt, weil sie schwimmen, um die Homogenität in die Lösung (2C, rechts Zellen). Da die Rückspülung Technik hat sehr wenig Einfluss auf die Samenzellen, so erhält man in der Nähe von 100% Beweglichkeit und die Zellen verteilen sich schnell in die Medien ohne externe Provokation. In einem typischen Experiment Rückspülung, Sperma erholte sich von der Swiss-Maus enthältzwischen 1-5 x 10 6 Zellen. Diese ist stark abhängig von dem Alter des Tieres und kann aus verschiedenen Mäusestämmen variieren. In einer norwegischen Ratte, wir in der Regel erhalten, 200 x 10 6 Spermien, ± 20%. 2D steht für die Reinheit der Spermien aus dem Nebenhoden der Ratte Cauda erhalten. Neben der Probe selbst, ist eine der wichtigsten Fragen im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung die Ausbeute an Trypsinverdau. Proteinfällung spielt eine wichtige Rolle nicht nur bei der Entfernung von unerwünschten Detergentien und Salze, die beide mit MS nicht kompatibel sind, sondern auch in Proteine ​​zu denaturieren. Wir haben die Methanol-Chloroform Fällung am besten zu funktionieren gefunden. Nicht nur, dass diese Vorgehensweise wurde berichtet, dass geringe vorkommenden Proteine ​​besser als andere mit TCA-Fällung 19 zu fällen, aber es zusätzliche Vorteile hat. Folgende TCA-Fällung, ist es oft notwendig, den pH-Wert nach der Aussetzung des TCA-Pellet, die ganz bleibt korrigieren könnensauer. Obwohl das ausgefällte Pellet von TCA in hohen organischen Lösungen gewaschen, um die Säure zu entfernen, fügt dieser die Handhabung und Nichtreproduzierbarkeit der Ergebnisse abzutasten. Bei Nichtbeachtung der Säure zu neutralisieren wird in armen tryptischen Peptidausbeuten. Methanol-Chloroform Fällung ist nicht nur schnell, aber nicht die Probe zu säuern. Abbildung 3 zeigt die Proteinpellet der Regel von 100 ug Probe zwischen der unteren und der oberen Zwischenphase zu sehen. Die Isolierung der Phosphopeptide können in einer Reihe von Arten erfolgen; jedoch Reproduzierbarkeit davon abhängig, wie die Probe wurde bis zu handhaben und mit diesem Zeitpunkt. Eines der häufigeren, Entwicklungsverfahren ist TiO 2, die ursprünglich von der Gruppe von Martin Larsen 18,20,21 entwickelt. Obwohl als ein Prozess in Mikrosäulen verwenden beschrieben, können wir reproduzierbare Daten zu erhalten, mit der Batch-Chromatographie. Der Erfolg des Prozesses ist stark abhängig von dem Elutionspuffer, welche verrückt sein muss<html> e mit der richtigen Zusammensetzung; andernfalls Phosphopeptide haupt nicht eluiert. Die Reproduzierbarkeit der Protokoll und repräsentative Daten aus TiO 2 angereichert Phosphopeptiden aus Nebenhodensperma in einem unbeweglichen (Abbildung 4 oben) und beweglichen (Abbildung 4 unten) Zustand von m / z 650 bis 670 kann sehen. Wir haben gezeigt, daß dies eine äußerst reproduzierbare Technik auch bei Verwendung von biologischen Replikaten 17. Die blauen Streifen über der Zeit erscheinen, sind Peptide Elution aus einer C18 Nanosäule als die Konzentration von Acetonitril zu. Offensichtlich im motile Population (n = 3 dargestellt ist, n = 8 laufen typischerweise), gibt es ein Peptid-Cluster mit einem monoisotopische Masse um die 651,5 Da Bereich, der in dem unbeweglichen Bereich völlig abwesend ist. Tandem-Massenspektrometrie wird dann verwendet, um dieses Peptid zu identifizieren. 546 / 51546fig1highres.jpg &quot;/&gt; Abb. 1: Kanülierung der Cauda Nebenhoden (A) Bild von der Cauda Nebenhoden. Die Kanüle selbst ist unten mit Klebeband auf ca. 1-2 cm von der Pre-gezogen Ende aus. Dies wird mit feinen # 5watchmakers Pinzette in die Samenleiter eingesetzt ist. (B) Die Kanüle wird durch Binden feiner Seide um ein Segment, das sowohl die Samenleiter und die Kanüle gehalten. Aus der Maus, sind etwa 2-3 ul Schwanz epididymalen Zellen und Fluid in einer Konzentration von 1 x 10 6 / &amp; mgr; l gesammelt. Von der Ratte (dargestellt) werden etwa 30-40 &amp; mgr; l Flüssigkeit in ähnlichen Konzentrationen erhalten. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: verwendet, um kompetente Nebenhoden Samenzellen sammeln Glaskapillar-. (A) Ein Röhrchen von dem Scheitelpunkt der Cauda e<html> pididymis ist isoliert und gebrochen. Die ungefähre Position aus dem dies geschieht, wird angezeigt. (B) Die oben im Bild zeigt ein leeres Glas Kapillare und die untere zeigt eine aus einer zuvor rückgespült Ratte. Es gibt keine Blutkontamination und minimale Epithelzelle Verunreinigungen. (C) Als der Spermien noch im Nebenhoden Fluidunverdünnt, werden sie nicht begonnen haben, zu aktivieren. Wenn die Samenzellen werden in einem BWW-Lösung vertrieben, kommen sie als kompakte &quot;string&quot; (linke Seite). Die Kompetenz der Zelle wird leicht feststellen, da nach 10 Minuten die meisten der Spermien schwimmen in Lösung ohne externe Störung (rechte Seite). (D) Ein Bild von einem aliquoten Teil der Schwanznebenhodenzellen unmittelbar nachdem sie verlassen, um zu schwimmen out zeigt die Reinheit der Zellen. g3highres.jpg &quot;/&gt; Fig. 3: Methanol-Chloroform-Ausfällung Sobald Spermatozoen wurden solubilisiert, ist die lösliche Fraktion Methanol- Chloroform ausgefällt, um die Denaturierung der Proteine ​​und die Entfernung von kontaminierenden Stoffen zu gewährleisten. Das Protein Pellet wird in der Grenzfläche zwischen den Methanol / Wasser-und Chloroformphasen. Die obere Schicht wird sorgfältig entfernt, um nicht diese Pellet zu zerstören. Es ist üblich, etwa 2-3 mm von der oberen Phase zu verlassen, so daß kein Protein verloren geht. <img alt="4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51546/51546fig4highres.jpg" width="600" /> Abb. 4: Typische TiO 2 angereicherte Phosphopeptid Profil Mit dem beschriebenen Protokoll wurden Schwanznebenhoden-Spermien entweder immotile isoliert (oben, N = 3) oder bewegliche Staaten (unten, N = 3). Ein Peptid-Cluster mit einem Mono-Isotopenmasse von ~ 651,5 Da gezeigt, in den beweglichen Populationen vorhanden, aber völlig abwesend in den immotile diejenigen (Pfeil) zu sein. Vergleiche dieser Art werden als &quot;markierungsfreie (MS-basiert)&quot; bezeichnet. Die Peptidmasse und die Retentionszeit werden dann verwendet, um die Verbindung zum Tandemmassenspektrometrie zielen und zu identifizieren, die das Protein, von dem das Peptid abgeleitet wurde.

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Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Phosphopeptid Analyse der Nebenhoden Nagetier Spermien

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

phosphopeptide-analysis-of-rodent-epididymal-spermatozoa

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Aufrufe.  University of Newcastle. Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Serie: Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Forschung

Biologie

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

Die Methode der Nager Whole Embryo Culture mit der Rotator-type Bottle Kultur-System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform surgery on a rodent. Students, post-doctoral scholars, and others interested in performing surgery on rodents as part of a research protocol may not have had formal surgical training as part of their required coursework. Surgery itself is a technical skill, and one that will improve with practice. The principles of aseptic technique, however, often remain unexplained or untaught. For most new surgeons, this vital information is presented in piecemeal fashion or learned on the job, neither of which is ideal. It may also make learning how to perform a particular surgery difficult, as the new surgeon is learning both a surgical technique and the principles of asepsis at the same time. This article summarizes and makes recommendations for basic surgical skills and techniques necessary for successful rodent surgery. This article is designed to supplement hands-on training by the user's institution.

Before attempting surgery, a new surgeon should have training in basic surgical techniques and concepts. This article will present basic surgical considerations with an emphasis on rodents.

Principles of Surgery Nager für die New Surgeon

For both scientific and animal welfare reasons, training in basic surgical concepts and techniques should be undertaken before ever seeking to perform ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Ex-vivo-Verfahren für High Resolution Imaging von Cilia Motilität in Nagetier Atemwegsepithelien

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways that cannot be accomplished in vivo. For example, inotropic medications commonly also affect preload and afterload, precluding load-independent assessments of their myocardial effects in vivo. Additionally, this model allows for sampling of coronary sinus effluent without contamination from systemic venous return, permitting assessment of myocardial oxygen consumption. Further, the advent of miniaturized pressure-volume catheters has allowed for the precise quantification of markers of both systolic and diastolic performance. We describe a model in which the left ventricle can be studied while performing both volume and pressure work under controlled conditions. 
In this technique, the heart and lungs of a Sprague-Dawley rat (weight 300-500 g) are removed en bloc under general anesthesia. The aorta is dissected free and cannulated for retrograde perfusion with oxygenated Krebs buffer. The pulmonary arteries and veins are ligated and the lungs removed from the preparation. The left atrium is then incised and cannulated using a separate venous cannula, attached to a preload block. Once this is determined to be leak-free, the left heart is loaded and retrograde perfusion stopped, creating the working heart model. The pulmonary artery is incised and cannulated for collection of coronary effluent and determination of myocardial oxygen consumption. A pressure-volume catheter is placed into the left ventricle either retrograde or through apical puncture. If desired, atrial pacing wires can be placed for more precise control of heart rate. This model allows for precise control of preload (using a left atrial pressure block), afterload (using an afterload block), heart rate (using pacing wires) and oxygen tension (using oxygen mixtures within the perfusate).

Isolated working heart models can be used to measure the effect of loading conditions, heart rate, and medications on myocardial performance and oxygen consumption. We describe methods for preparation of a rodent left heart working model that permits study of systolic and diastolic performance and oxygen consumption under various conditions.

Nagetier Arbeits Herz Modell für die Untersuchung der myokardialen Leistung und Sauerstoffverbrauch

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident adipose progenitor cells (APCs) play a key role in adipose tissue homeostasis and can contribute to the tissue pathology. The growing use of single cell analysis technologies &#8211; including single-cell RNA-sequencing and single-cell proteomics &#8211; is transforming the stem/progenitor cell field by permitting unprecedented resolution of individual cell expression changes within the context of population- or tissue-wide changes. In this article, we provide detailed protocols to dissect mouse epididymal adipose tissue, isolate single adipose tissue-derived cells, and perform fluorescence activated cell sorting (FACS) to enrich for viable Sca1+/CD31-/CD45-/Ter119- APCs. These protocols will allow investigators to prepare high quality APCs suitable for downstream analyses such as single cell RNA sequencing.

We present a simple method to isolate highly viable adipose progenitor cells from mouse epididymal fat pads using fluorescence activated cell sorting.

Herstellung von Adipose-Progenitorzellen aus Maus-Epididymal-Adipose-Geweben

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

Rodent Estrous Cycle Monitoring Utilizing Vaginal Lavage: No Such Thing As a Normal Cycle

The current methodology establishes a reproducible, standardized, and cost-effective approach to monitoring the estrous cycle of female Sprague Dawley (SD) adolescent rats. This study demonstrates the complexity of hormonal cycles and the broad spectrum of understanding required to construct a reliable and valid monitoring technique. Through an in-depth examination of principal experimental design and procedural elements,&#160;this description of the cycle and its fundamental principles provides a framework for further understanding and deconstructs misconceptions for future replication.
Along with an outline of the sample collection process employing vaginal lavage, the procedure describes the mechanism of data categorization into the four-stage model of proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. These stages are characterized by a new proposed approach, utilizing the 4 categorizing determinants of vaginal fluid condition, cell type(s) present, cell arrangement, and cell quantity at the time of collection. Variations of each stage, favorable and unfavorable samples, the distinction between cyclicity and acyclicity, and graphic depictions of the collected categorizing components are presented alongside effective interpretive and organizational practices of the data. Overall, these tools allow for the publication of quantifiable data ranges for the first time, leading to the standardization of categorization factors upon replication.

This study details the crucial factors to consider in experimental designs involving female rats. In a larger sense, these data serve to decrease stigma and assist in the development of more inclusive diagnostic and intervention tools.

Nagetier-Östruszyklus-Überwachung mit vaginaler Lavage: So etwas wie ein normaler Zyklus nicht

The current methodology establishes a reproducible, standardized, and cost-effective approach to monitoring the estrous cycle of female Sprague Dawley ...