So ermöglicht unser Modell die Untersuchung der post-transkriptionellen Modulation eines bestimmten Transkripts in alveolar epitheliale Zellen in der Primärkultur und ihre physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen. Die transiente Transfektion von primären alveolären Epithelzellen hat also nur minimale Auswirkungen auf die Zellphysiologie und den Stoffwechsel, was einen klaren Vorteil gegenüber klassischen Protokollen mit Transkriptionsinhibitoren darstellt. Für die Erzeugung eines Antwortplasmids, das ein Gen von Interesse ausdrückt, müssen die Sequenz des Gens und die mehrfachen Klonstellen des induzierbaren Vektors analysiert werden, um die Erkennungssequenzen in den mehreren Klonstellen zu identifizieren, die intern im Gen nicht vorhanden sind.
Mit High-Fidelity-Taq-Polymerase und Standard-ÜberlappungPCR-Techniken, flankieren Sie das Gen von Interesse mit zwei ausgewählten Restriktions-Enzym-Erkennungsstellen mit Designer-Primern. Eine Sequenz bei der Codierung des V5-Epitops vor dem Gen von Interesse muss enthalten sein, um die Expression des transfizierten Gens von der endogenen Expression zu unterscheiden. Mutanten können durch sequenzielles Löschen erzeugt werden, um die Auswirkungen verschiedener drei erlesener Hauptregionen auf die Stabilität der mRNA des Gens mithilfe von Reverse Primern zu untersuchen, die eine Polyadenylierungsstelle kodieren, die nach und nach das drei Primendedes der nicht übersetzten Region löscht.
Letztlich kann die Einfügung des Gens von Interesse durch Eine Restriktionsanalyse bestätigt werden. Die Genorientierung und das Fehlen von Mutationen, die möglicherweise während der rtPCR eingeführt werden, können durch Sequenzierung bestätigt werden. Für die Transfektion der primären Rattenlunge Typ zwei Alveolar Epithelzellen, Samen der Zellen bei einem mal 10 bis sechs Zentimeter pro Quadratzentimeter in 100 Millimeter Petrischalen in Gegenwart von vollständigen minimalen essentiellen Medium.
Kultur für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid mit Feuchtigkeit. Am nächsten Tag 500 Mikroliter komplettes Medium ohne Antibiotikum in jeden Brunnen einer neuen 12-Brunnenplatte geben und die Platte 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius vorwärmen. Während dieser Inkubation fügen Sie ein Mikrogramm des Reaktionsplasmids und ein Mikrogramm regulatorischen Vektors zu einem 1,5 Milliliter-Rohr pro Brunnen hinzu.
Waschen Sie die Alveolar-Epithelzellen mit 10 Millilitern pro Brunnen von 37 Grad Celsius PBS ohne Kalzium oder Magnesium und behandeln Sie die Zellen mit fünf Millilitern pro Brunnen von 37 Grad Celsius 0,05%Trypsin für zwei bis vier Minuten im Zellkultur-Inkubator. Wenn sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie das Trypsin mit 10 Millilitern pro Brunnen des kompletten Mediums ohne Antibiotikum und sammeln Sie die Zellen in einer neuen 50-Milliliter-Röhre. Waschen Sie die Schale mit vier Milliliterfrischem Medium, um die verbleibenden Zellen zu sammeln und die Zellen durch Zentrifugation zu sedimentieren.
Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS für das Zählen und Zentrifugieren der Zellen wieder aus. Setzen Sie das Pellet mit einer Dichte von viermal 10 bis zu den siebten Zellen pro Milliliter Resuspensionspuffer aus und fügen Sie den fünften Zellen mit sanfter Mischung viermal 10 zu den fünften Zellen hinzu. Legen Sie ein Rohr in die Elektroporationsvorrichtung und füllen Sie das Rohr mit 3,5 Milliliter elektrolytischen Puffer.
Drücken Sie den Kolben vollständig, um eine vergoldete Elektrodenspitze in eine Pipette einzufügen, und mischen Sie den Rohrinhalt vorsichtig. Die Zellen vorsichtig mit einer Pipette ansaugen und die Pipette in die Elektroporationsstation einlegen, bis ein Klickton ertönt. Wählen Sie das entsprechende Elektroporationsprotokoll für Alveolar-Epithelzellen aus und drücken Sie Start auf dem Touchscreen.
Unmittelbar nach der Transfektion die Pipette entfernen und die Zellen in einen Brunnen der vorgewärmten 12 Brunnenplatte übertragen. Wenn alle Zellen elektropoiert und plattiert wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator und ersetzen Sie den Überstand in jedem Brunnen durch ein komplettes Medium mit Antibiotika nach zwei Tagen. Der Erfolg der Transfektion kann durch die Expression von EGFP bestätigt werden, wie sie durch Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie mit einem Kontrollvektor beobachtet wird.
Um die Transkription des Gens von Interesse zu hemmen, ersetzen 72 Stunden nach der Transfektion den Überstand durch einen Milliliter pro Brunnen des kompletten Mediums, ergänzt durch ein Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetes Addoxycyclin. Um die mRNA-Halbwertszeit des gens von Interesse zu bewerten, geben Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator von 15 Minuten bis sechs Stunden zurück. Waschen Sie einen gut mit einem Milliliter eiskaltes PBS, bevor Sie die Zellen mit 500 Mikroliter Lysepuffer aus einem handelsüblichen Phenolchlorform-RNA-Extraktionskit und sanftem Schütteln zu jedem experimentellen Zeitpunkt lysieren.
Isolieren Sie dann die RNA gemäß den Kit-Anweisungen und bestimmen Sie die RNA-Ausbeute und -Reinheit durch Spektrophotometrie bei 230, 260 und 280 Nanometern. Um die Stabilität der isolierten RNA zu bestimmen, behandeln Sie zunächst ein Mikrogramm der gesamten RNA aus jeder Probe mit RNase freier DNase, um alle Plasmid-DNA-Spuren zu entfernen. Verwenden Sie ein handelsübliches cDNA-Synthesekit mit einer Mischung aus Oligo dT und zufälligen Hexomer-Primern, um die Reverse-Transkriptionseffizienz zu verbessern, um die DNA-erschöpfte Gesamt-RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA umzuschreiben.
Fügen Sie 180 Mikroliter molekularbiologisches Wasser zu den 20 Mikrolitern des Reaktionsmixes hinzu, um die cDNA-Reaktion bei einer Konzentration von fünf Nanogramm pro Mikroliter zu verdünnen und sofort den cDNA-Mix mit frischem molekularbiologischem Wasser zu verdünnen, um eine Konzentration von 1,25 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen. Kombinieren Sie fünf Mikroliter Cyber-Grünfarbstoff-Master-Mix mit 0,1 Mikroliter molekularbiologischem Wasser, 0,45 Mikroliter 7,5 Mikromolchen-Vorwärtsgrundierung, 0,45 Mikroliter 7,5 Mikromol-Reverse-Primer und vier Mikroliter 1,25 Nanogramm pro Mikroliter cDNA, um ein Gesamtreaktionsvolumen von 10 Mikrolitern zu erhalten. Legen Sie die Proben in einen qPCR-Thermocycler und verstärken Sie das V5-Tag-Gen von Interesse und Tetrocyclin-Transaktivator-Advance-Amplicons unter Verwendung der angegebenen qPCR-Bedingungen und erzeugen Sie eine hochauflösende Schmelzkurve, um die spezifischen Schmelztemperaturen der gewünschten Amplicons zu bewerten und das Fehlen von Rauschamplikonspitzen zu gewährleisten.
Diese Pipettenelektroporationstechnik ermöglicht eine Transfektionseffizienz rate von 25 bis 30%, wie sie anhand der durch Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie nachgewiesenen Verhältnisse von EGFP-Zellen beobachtet wird. Die Behandlung von Alveolar-Epithelzellen mit einem Mikrogramm pro Milliliter Doxycyclin hat keinen signifikanten Einfluss auf die Expression endogener Alpha-ENaC-mRNA zu irgendeinem Zeitpunkt während des Behandlungszeitraums. Mit Hilfe eines transkriptionsgesteuerten Plasmidexpressionssystems, wie gezeigt, konnte das V5 alpha ENaC-Signal gemäß dem fortgeschrittenen Tetracyclin-Transaktivator normalisiert werden, um die Effizienz der Transfektion mit der Methode des doppelten Delta-Quantifizierungszyklus zu bestimmen.
Die Halbwertszeit von alpha ENaC mRNA ist in Gegenwart des Tetracyclin-Off-Systems bis zu siebenmal kürzer als in Gegenwart von Actinomycin D, was bestätigt, dass Actinomycin D zu einer artefaktischen Alpha-ENaC-mRNA-Stabilisierung führt. Darüber hinaus verringerte die Cyclohexamid- und Tumornekrosefaktor-Alpha-Behandlung die Stabilität des Transkripts signifikant, während Lipopolysaccharide dies nicht tun. Signifikante Veränderungen in der Modulation der V5 alpha ENaC mRNA-Stabilität können in Abhängigkeit von den gelöschten und eingeschlossenen Regionen der drei wichtigsten unübersetzten Regionen induziert werden.
Darüber hinaus verringert die Überexpression spezifischer RNA-bindender Proteine die Stabilität von 5-alpha ENaC mRNA im Vergleich zur Transfektion mit einem leeren pcDNA-Drei-Plasmid. Dieses Tool wird nützlich sein, um neue Erkenntnisse über die posttranskriptionelle Regulation von Schlüsselgenen, die in die Funktion des Alveolarepithels und deren physiologische oder pathologische Bedingungen involviert sind, zu hinterfragen.
