Die Etablierung dieses humanisierten Mausmodells kann in präklinischen HIV-Forschungsstudien helfen. Beispielsweise können sowohl verschiedene Virusstämme als auch neuartige HIV-Interventionen bewertet werden. Diese Protokolle können verwendet werden, um den Variantenstatus des Stammzellspenders CCR5 zu bewerten und humanisierte Mäuse effizient mit HIV zu infizieren und die Viruslast von Mausplasma zu quantifizieren.
Das RNA-Quantifizierungsprotokoll kann leicht angepasst werden, um jede virale RNA-Sequenz nach Wahl zu quantifizieren, die in Plasmaproben nachweisbar ist. Für das genetische Screening von Nabelschnurblutproben für CCR5 Delta 32-Varianten 1,25 Mikroliter nicht-pelletierter Durchflussmittel mit 11,25 MikroliterPCR-Mix mit 200 Mikromolaren-dNTP-Mix, 0,01 Einheit pro Mikroliter Hochtreue-DNA-Polymerase sowie Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, wie in der Tabelle beschrieben. Stellen Sie das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf ca. 12,5 Mikroliter pro PCR-Reaktion ein und verstärken Sie die genomischen Fragmente mit dem PCR-Zyklusprogramm, wie in der Tabelle angegeben.
Trennen Sie am Ende der Reaktion die PCR-Produkte auf einem 2%Agarose-Gel. PCR-Produkte aus den Wild-Typ-Allelen und den Delta-32-Allelen ergeben PCR-Fragmente von 196 Basenpaaren bzw. 164 Basenpaaren, wodurch die Bänder leicht durch Gelelektrophorese unterschieden werden können. Für intravaginale HIV-Exposition, legen Sie eine Heizlampe auf die Mitte des Arbeitsbereichs, wo die Maus befindet und legen Sterile 20 Mikroliter Pipettenspitzen in einer geeigneten Pipette in die Haube.
Legen Sie einen Behälter mit flüssigem Desinfektionsmittel in die Haube, um Material und Flüssigkeiten, die mit dem Virus in Berührung gekommen sind, sofort zu inaktivieren. Legen Sie die anästhesierte Maus auf ein steriles blaues Pad in der Rückenposition unter der Lampe mit dem Schwanz der Maus mit Blick auf die Rückseite der Kapuze und bestätigen Sie die mangelnde Reaktion auf Pedalreflex in der Maus. Greifen Sie das Tier an der Basis des Schwanzes.
Heben Sie die Maus vorsichtig an der Schwanzbasis, unterstützen Sie das Tier in einer aufdemkopf aufrechten Position. Verwenden Sie eine sterile Rohrspitze, um den Genitalbereich mit sanftem Streichen in Richtung Desus zu stimulieren, um eine Entleerung des Rektums zu induzieren und den Druck auf die Vagina zu verringern. Um die vaginale Öffnung freizulegen, wickeln Sie vorsichtig den Mausschwanz über die Finger, so dass sich die Vulva natürlich öffnet.
Mit einer neuen Pipette-Spitze, legen Sie die Spitze auf der Ebene der vaginalen Öffnung und atraumatisch freisetzen 20 Mikroliter des Virus in die Vagina, so dass die Schwerkraft die virale Suspension in die Vagina ziehen. Wenn das gesamte Virus geliefert wurde, halten Sie die Maus in dieser Position für fünf Minuten, um ein durch die Schwerkraft verursachtes Auslaufen des Virus zu vermeiden. Dann kehren Sie die Maus vorsichtig in ihren Heimkäfig in der Supine-Position zurück und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.
Um RNA aus aufgetauten Mausplasmaproben zu isolieren, verwenden Sie ein Virus-RNA-Isolationskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Fügen Sie die Probe hinzu, die an die Spalte bindet, und fügen Sie einen on-column DNase-Behandlungsschritt hinzu, um die Entfernung der gesamten DNA innerhalb der Plasmaprobe sicherzustellen. Dann lagern Sie die RNA-Proben bei 80 Grad Celsius für mindestens eine Stunde.
Um cDNA zu synthetisieren, verwenden Sie Reverse-Transkriptase gemäß Standardprotokollen, einschließlich 0,5 Mikroliter eines RNase-Inhibitors innerhalb der cDNA-Reaktion, um den RNA-Abbau zu vermeiden, führen Sie dann eine cDNA-Synthese durch, wie in der Tabelle beschrieben, und speichern Sie die cDNA-Proben mindestens eine Stunde lang bei 80 Grad Celsius. Zur Vorbereitung von Proben für ddPCR 11 Mikroliter ddPCR-Sondenreaktionsgemisch mit Polymerase und dNTPs mit 250 Nanomolaren kleiner Nutbindungssonden und 900 Nanomolaren der Vorwärts- und Rückwärtsprimer mischen, wie in der Tabelle angegeben. Fügen Sie drei Mikroliter jeder cDNA-Probe hinzu und passen Sie das gesamte PCR-Volumen auf 22 Mikroliter mit nukleasefreiem Wasser an.
Verwenden Sie Tröpfchen-Erzeugungsöl für Sonden auf einem Tröpfchengenerator gemäß dem Herstellerprotokoll, um die PCR-Mischungen zu emulgieren. Führen Sie dann das PCR-Programm wie in der Tabelle beschrieben aus. Für die cART-Behandlung nach einer bestätigten HIV-Infektion füttern Sie die Mäuse mit Pellets, die von einem externen Anbieter hergestellt wurden und ein CART-Standardschema enthalten, wie in der Tabelle angegeben.
Verwenden Sie eine rote cART-Diät, um sie leicht von gewöhnlichen Maus-Chow zu unterscheiden und verwenden Sie eine Kontroll-Chow-Diät ohne cART in einer Standard-braunen Farbe. Zur Einleitung der Behandlung die cART-haltige Chow-Diät in sterile Käfige legen, bevor Sie die Mäuse aus dem alten Käfig in den neuen Käfig überführen. Überwachen Sie dann die Gewichte der Mäuse und überprüfen Sie täglich den Verbrauch von cART-haltigem Chow, um sicherzustellen, dass sich die Mäuse an die Veränderung anpassen.
Hierwird wird die Strömungszytometrie-Gating-Strategie zur Analyse der Stammzellreinheit dargestellt, wobei die Reinheit der isolierten CD34-positiven Stammzellen typischerweise zwischen 85 und 95% mit einer Kontamination von weniger als 1%T Zell liegt. Die PCR-Analyse zeigt den CCR5-Variantenstatus der gereinigten Spenderstammzellen, wodurch CCR5 delta 32 heterozygote Spender leicht identifizierbar werden. Die Häufigkeit des mutierten Genotyps in einer Gruppe von 19 Spendern lag in Übereinstimmung mit größeren epidemiologischen Studien an skandinavischen Populationen bei etwa 15,8 %.
Drei bis fünf Monate nach der Adoptionsübertragung von 7,5 mal 10 in die 4. menschlichen CD45-positiven Zellen in Empfängermäuse sind 20 bis 50 % der weißen Blutkörperchen, die aus den peripheren Blutproben des Empfängers gewonnen wurden, menschliche CD45-positive Zellen und die Mäuse werden menschliche B- und T-Zellen entwickelt haben. 64 % der Mäuse werden nach einer vaginalen Exposition mit HIV infiziert, wie gezeigt. Vier Wochen nach der Umstellung auf eine 40-Tage-Diät, die Standard-CART enthält, sinken die Viruslasten bei HIV-positiven Mäusen unter die Nachweisgrenze.
Nach Beendigung der Diät erholt sich das Virus und spiegelt klinische Daten wider. Wichtig ist, dass Mäuse auf cART die Ernährungsumstellung gut vertragen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Tiere immundefizi0retge und daher anfällig für die Umwelt sind.
Die Einhaltung aseptischer Techniken wird den Allgemeinen Erfolg der Tiergesundheit und des Protokolls erhöhen. Nach der Einrichtung der humanisierten Mauskohorte für HIV-Infektionen kann das Protokoll für die virale RNA-Quantifizierung in Geweben oder für die Erprobung neuartiger Interventionen in verschiedenen Virusstämmen angepasst werden. Die Flexibilität und Zugänglichkeit humanisierter Mäuse für HIV-Infektionsstudien haben kritische Fortschritte in der HIV-Virologie, Immunologie und Behandlungsforschung ermöglicht.
Bevor Sie Protokolle mit infektiösem HIV versuchen, sollten Sie die Genehmigung von lokalen Umweltbeamten einholen und die zugelassenen Dekontaminationsverfahren einhalten.
