Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung eines homogenen Glykonojugat-Impfstoffs durch die Kombination von nicht-kanonischer Aminosäure-Inkorporation und Klickchemie. Genetische Code-Erweiterung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um unnatürliche Aminosäuren in Proteine zu integrieren, um ihre Eigenschaften zu ändern, um neue Proteinfunktionen zu untersuchen oder zu schaffen oder um Zugang zu Proteinkonjugaten zu haben. Eine Codon-Unterdrückungsmethode hat sich als die beliebteste Methode zur Integration unnatürlicher Aminosäuren an verschiedenen Positionen herausgestellt.
Diese Methode wird hier auf die Herstellung eines Proteinträgers angewendet, der eine unnatürliche Aminosäure enthält, die eine bioorthogonale funktionelle Gruppe enthält. Dieser reaktive Griff kann als nächstes verwendet werden, um ein synthetisches Oligosaccharid-Hapten gezielt und effizient zu transplantieren, um einen homogenen Glykonojugate-Impfstoff bereitzustellen. Das Propargyllysin, PrK, wird in zwei Schritten von kommerziellem Boc-Lysin synthetisiert.
Im ersten Schritt wird die ungeschützte Aminogruppe des Boc-Lysins in Propargylchloroforat umgewandelt. In einem zweiten Schritt wird die Alpha-Aminogruppe entschützt. Um das N(alpha)Boc-Propargyl-Lysin zu synthetisieren, lösen Sie zunächst 500 Milligramm Boc-Lysin in der Mischung aus fünf Millilitern wässriger Mol-NaOH und fünf Milliliter THF in einem Kolben auf und passen den Kolben mit einem Siliziumseptum an.
Kühlen Sie den Kolben in einem Eisbad ab und warten Sie, bis das Pulver gelöst ist. Dann fügen Sie das Propargylchloroformate tropfenweise über einen Zeitraum von zwei bis drei Minuten unter Rühren hinzu. Das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur erwärmen und 10 Stunden rühren.
Abkühlen von Lösungen aus Diethylether, wässrige 1 Molsalzsäure und Ethylacetat. Kühlen Sie die rohe Reaktionsmischung in einem Eisbad ab. Gießen Sie die Mischung in einen trennenden Trichter.
Eine Mischung mit fünfzig Millilitern Diethylether extrahieren. Extraktion kann zu einer Anhäufung von Druck führen, stellen Sie sicher, dass Sie druckaufbau häufig loslassen. Sammeln Sie die wässrige Phase und entsorgen Sie die organische Schicht.
Fügen Sie vorsichtig, fünfzig Milliliter einer Molsalzsäure in die wässrige Phase im Trenntrichter. Dann extrahieren Sie die wässrige Schicht zweimal mit dreißig Milliliter Ethylacetat. Sammeln Sie die organische Phase, Überprüfen Sie das Vorhandensein Ihrer Verbindung durch TLC.
In diesem Stadium sollte es in der organischen Phase sein. Trocknen Sie die kombinierten organischen Schichten über Magnesiumsulfat. Filtern Sie die Festphase ab.
Und konzentrieren Sie das Filtrat unter reduziertem Druck auf einen Rotationsverdampfer. Die Probe des rohölöligen N(alpha)Boc-Propargyl-Lysins in deuteriertem Chloroform auflösen und seine Identität durch NMR kontrollieren. Um das Propargyl-L-Lysin zu synthetisieren, führen Sie das N(alpha)Boc-Propargyl-Lysin in einen runden Knopfkolben ein, der mit einem Septum ausgestattet ist.
Vier Milliliter wasserfreies Dichlormethan unter Argon in den Kolben geben. Tropfenweise vier Milliliter Trifluoressigsäure unter Rühren hinzufügen. Ersetzen Sie das Siliziumseptum durch einen Glasdeckel, um zu vermeiden, dass TFA das Siliziumseptum beschädigt.
Rühren Sie das Reaktionsgemisch für eine Stunde bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie den De-Schutz des Boc-PrK durch TLC. Konzentrieren Sie das Reaktionsgemisch unter reduziertem Druck.
Den Rohresten mit Derthylether ergänzen. Filtern Sie das Propargyl-L-Lysin in Form eines weißen Festkörpers auf einem Fritglas. Lösen Sie ein Aliquot des Propargyl-L-Lysins in Deuteriumoxid auf und führen Sie dann eine NMR-Analyse durch, um ihre Identität und Reinheit zu kontrollieren.
Propargyl-L-Lysin wird dann in destilliertem Wasser in der Endkonzentration von hundert Millimolar gelöst und bei minus 20 Grad in einem Milliliter Aliquots gelagert. Um Plasmide in den Expressionsstamm zu transformieren, tauen Sie fünf Minuten lang ein hundert Mikroliter Aliquot des chemisch kompetenten E.Coli BL21 auf Eis auf. Fügen Sie einen Mikroliter von jedem Plasmid oder fünfzig bis hundert Nanogramm von jedem in die Zellen und inkubieren Sie sie für 30 Minuten auf Eis.
Inkubieren Sie die kompetenten Zellen bei 42 Grad, während 45 Sekunden. Dann legen Sie sie für zwei Minuten wieder auf Eis. Fügen Sie neunhundert Mikroliter LB Medium und inkubieren unter Schütteln für eine Stunde bei 37 Grad, um Antibiotika-Expression zu ermöglichen.
Dann die transformierten Bakterien auf LB Agar mit Antibiotika plattieren. Lassen Sie Bakterien über Nacht bei 37 Grad wachsen. Um mit PrK modifizierte Proteine auszudrücken, impfen Sie eine einzige kotransformierte Kolonie in fünf MilliliterN LB-Medium mit Antibiotika.
Über Nacht bei 37 Grad mit Schütteln inkubieren. Am nächsten Tag mit den fünf Millilitern Primärkultur in fünfhundert Millilitern Autoinduktionsmedium mit Antibiotika, 0,02% L-Arabinose und einem Millimolar PrK verdünnen und 24 Stunden lang unter Schütteln bei 37 Grad brüten. Schließen Sie eine negative Kontrolle ein, indem Sie die Kultur ohne PrK und die positive Kontrolle durchführen, indem Sie die Kultur eines Klons ausführen, der das Wildtyp-Proteingen enthält.
Ernten Sie Zellen aus der Nachtkultur durch Zentrifugation bei 5.000 x g während 10 Minuten. Den Überstand entsorgen und bei minus 20 Grad einfrieren. Zur Reinigung des Proteins durch Gravitations-Flow-Bench-Affinitätschromatographie setzen Sie die Zellpellets in zwanzig Milliliter Lysepuffer aus.
Fügen Sie DNase I und Lysozym hinzu und lassen Sie die Lyse durch Inkubieren der Suspension bei 37 Grad während 30 Minuten. Beschallen Sie die Zellen im Eis während fünf Minuten, dann entfernen Sie die Zellablagerungen durch Zentrifugation bei 20.000 x g während 30 Minuten. Filtrieren Sie das Lysat mit 0,45 Mikrometer Filter Fügen Sie Ni-NTA Harz zur Suspension hinzu.
Eine Stunde lang sanft bei vier Grad gemischt. Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule und sammeln Sie den ungebundenen Bruch. Waschen Sie das Harz mit zehn Millilitern und dann fünf Milliliter Waschpuffer.
Sammeln Sie die Waschfraktionen. Elute das His-tagged Protein mit einem Millimeter Elutionspuffer und wiederholen Sie diesen Schritt viermal und sammeln Sie alle zusätzlichen Fraktionen. Kombinieren Sie die Fraktionen, die reine Histidin-getaggte Proteine enthalten, und dialysieren Sie sie über Nacht in einem Liter TEV-Proteasepuffer mit Dialysemembran.
Sammeln Sie die Proteinprobe in eine 50-Milliliter-Röhre und fügen Sie den TEV-Puffer hinzu, um eine Endkonzentration von zwei Milligramm pro Milliliter in einem Endvolumen von einem Milliliter zu erhalten. Fügen Sie hundert Mikroliter TEV-Protease hinzu. Fügen Sie 50 Mikroliter 0,1 Mol DTT.
Komplett mit TEV-Puffer bis zu fünf Milliliter. Über Nacht bei vier Grad inkubieren, mit langsamem Schütteln. Um EDTA zu entfernen, dialysieren Sie das Protein bei vier Grad über Nacht mit Dialysemembran und Phosphatpuffer mit fünf Millimolar Imidazol.
Um TEV-Protease und unverdaute Proteine zu eliminieren, brüten Sie die Mischung mit Ni-NTA-Perlen und mischen Sie sanft für eine Stunde bei vier Grad. Gießen Sie die Suspension in eine Polypropylensäule. Die ungebundene Fraktion wurde gesammelt.
Die TEV-Protease und unverdaute Proteine bleiben an die Perlen gebunden und das verdaute Protein wird eluiert. Waschen Sie die Säule mit fünf Milliliter Waschpuffer und sammeln Sie auch die Waschfraktionen. Dialyse das verdaute Protein gegen einen Liter Klickpuffer bei vier Grad über Nacht mit Dialysemembran, um Imidazol zu entfernen sowie den Puffer auszutauschen.
Und messen Sie die Konzentration des Proteins bei 280 Nanometern. Um das mPsaA mit 6-Hexachlor-Fluorescein-Azid oder einem antidoten-funktionalisierten Kohlenhydrat-Antigen zu konjugieren, setzen Sie das PrK-mutierte Protein mit einer Konzentration von 57,8 Mikromolaren in eine Zwei-Milliliter-Mikroröhre. Fügen Sie 10 Mikroliter von fünf Millimolar-Azid-Verbindung, dann fügen Sie eine Vormischung von Kupfersulfat-Lösung und THPTA.
Aminoguanidinhydrochlorid hinzufügen. Extemporan zubereitete wässrige Lösung von Natriumascorbat hinzufügen. Schließen Sie das Rohr, mischen Sie, indem Sie mehrmals invertieren und bei Raumtemperatur für zwei Stunden inkubieren.
Beenden Sie die Reaktion, indem Sie EDTA hinzufügen. Überprüfen Sie die Konjugation auf der SDS-Seite. Nach der Migration visualisieren Sie das Gel auf UV-Licht bei 312 Nanometern für das Konjugat mit Fluorescein.
Oder färben Sie das Gel mit Coomassie Blue, um das Konjugat mit dem Kohlenhydrat-Antigen zu visualisieren. Als Zugabe des Haptens sollte eine Veränderung des Molekulargewichts induzieren. Reinigen Sie das Glykonojugate, indem Sie es auf eine mit PBS gleichgestellte Gelfiltrationssäule auftragen.
Sammeln Sie die Fraktionen, die die Glykonokjugate enthalten. Für eine längere Lagerung das Glykonojugate gegen das destillierte Wasser dialysieren, dann gefrieren und trocknen und das Glykonojugate bei minus 80 Grad lagern. Die PrK wurde an Position 32 eingeführt, um ein Lysin in der Nähe des N-Terminus der PsaA zu ersetzen.
Die Wirksamkeit der mPsaA-Produktion wurde durch SDS-Seite und Western-Blot-Analyse mit Anti-Histidin-Tag-Antikörper überprüft. Das Vorhandensein eines Vollblutproteins deutet stark auf die erfolgreiche Einbeziehung des PrK hin. Die Intensität ist jedoch geringer als bei Wildtyp mPsaA.
Die mPsaA(K32PrK)wurde auf Ni-NTA Perlen gereinigt. Mit einer typischen Ausbeute von acht Milligramm und der Aufnahme des PrK-Rückstandes wurde schließlich durch Massenspektrometrie bestätigt. Das Histidin-Tag wurde bei proteolytischer Spaltung mit der TEV-Protease entfernt.
Mit dem mPsaA(K32PrK)wurde die Reaktivität des Alkyns mit einem Azido-funktionalisierten Fluorescein bewertet und weiter verwendet, um ein synthetisches Oligosaccharid-Antigen zu konjugieren. Experimente wurden im Vergleich zu Wildtyp mPsaA als Kontrolle durchgeführt. Schließlich wurde das Glykoonjugate durch Gelfiltration gereinigt und seine Identität durch Massenspektrometrie bestätigt.
In diesem Projekt wurden homogene Glykonojugat-Impfstoffe mit hilfe der Bernstein-Stop-Codon-Unterdrückungstechnologie hergestellt, um eine unnatürliche Aminosäure unter definierten Stellen zu integrieren. Die Homogenität des Glycoconjugate-Impfstoffs ist ein wichtiges Kriterium, um eine vollständige physikalisch-chemische Charakterisierung zu gewährleisten. Und damit immer anspruchsvollere Empfehlungen der Drogenagenturen zu befriedigen.
Dieses Kriterium wird mit der klassischen reinen Konjugationsmethode nicht erfüllt. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll eine fein abgestimmte Abstimmung der Struktur des Glykonojugat-Impfstoffs. Es entsteht ein beispielloses Instrument, um die Beziehung zwischen homogenität und der Struktur eines Glykonokjugates zu untersuchen.
