Dies ist der erste Bericht, der zeigt, dass die echokardiographiegesteuerte, perkutane intramyokardiale Injektion von Kardiomyozyten die reparative Eigenschaft von humanen iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten signifikant verbessert. Diese Methode ist ein praktikables, zufriedenstellendes, wiederholbares, weniger invasives und wirksames Verfahren zur Verabreichung einer humanen iPS-abgeleiteten Kardiomyozytentherapie. Wir glauben, dass die perkutane intramyokardiale Verabreichung eine sichere und effiziente Methode zur lokalen Verabreichung von Medikamenten für Krankheiten wie ischämische Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz ist.
Dieses Projekt wird von Professor Jinfu Yang und Professor Jun Peng betreut. Xun Wu, Kele Qin und Kun Xiang, MD PhDs aus meinem Labor und Di Wang, ein PhD vom Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research, demonstrieren das Verfahren. Um zu beginnen, saugen Sie den Kulturüberstand aus einer 60-Tage-Kultur von hiPSC-CMs ab.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Anschließend werden die hiPSC-CMs mit der Zellablösungsenzymmischung bei 37 Grad Celsius drei bis fünf Minuten lang in einzelne Zellen dissoziiert. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter RPMI plus B27-Medium enthält, und mischen Sie.
Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 G für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Kardiomyozyten-Trägermedium auf eine Konzentration von 6 x 10 der 4. Zellen pro Mikroliter.
Stellen Sie das Röhrchen bis zum Injektionsschritt auf 37 Grad Celsius. Nachdem die Maus ausreichend betäubt ist, fixieren Sie die Gliedmaßen und den Schwanz mit Klebeband. Befestigen Sie dann die Schneidezähne der Maus mit einem 2/0-Seidenfaden und Klebeband.
Sterilisieren Sie den mittleren Hals und die linke Brust mit drei abwechselnden Runden Betain, gefolgt von Alkohol. Machen Sie einen mittleren Halsschnitt mit einer feinen anatomischen Schere und einer feinen Präparierzange. Schneiden Sie einige vordere Halsmuskeln ab, um die Luftröhre zu stabilisieren und vollständig freizulegen.
Führen Sie eine 20-Gauge-Katheterpunktionsnadel als Trachealtubus durch den Mund ein. Schließen Sie den Trachealtubus an das Beatmungsgerät an und überprüfen Sie die Bewegung des Brustkorbs, um sicherzustellen, dass beide Lungen gut belüftet sind. Passen Sie die Atemparameter an.
Befestigen Sie anschließend das linke Hinterbein wieder an der unteren rechten Seite und lösen Sie das Klebeband um das linke obere Glied. Führen Sie mit einer feinen Präparierschere und Pinzette eine Thorakotomie im drei bis vier Interkostalraum des linken Brustkorbs durch. Ziehen Sie mit einer Pinzette das Perikard ab und lokalisieren Sie die linke vordere absteigende Koronararterie.
Verwenden Sie einen 6/0-Seidenfaden, um das proximale Ende der Arterie zu ligieren. Um sicherzustellen, dass das Modell des akuten Myokardinfarkts etabliert ist, warten Sie, bis sich die distale Seite der Arterie an der Ligaturstelle von rot nach weiß ändert. Schließen Sie die Brust Schicht für Schicht und vernähen Sie die Haut mit 4/0 Faden.
Führen Sie bei der Scheingruppe von Tieren alle chirurgischen Eingriffe mit Ausnahme der Ligatur durch. Legen Sie die Mäuse in den ersten zwei Wochen nach dem Myokardinfarkt in eine Anästhesiebox, die mit 5% Isofluoran verbunden ist, und führen Sie eine Trachealintubation durch. Drei Tage vor der Verabreichung von hiPSC-CMs injizieren Sie Ciclosporin A in einer Dosis von 10 Milligramm pro Kilogramm pro Tag in die intraperitoneale Höhle.
Entfernen Sie die Haare von Brust und Oberbauch der Maus mit Enthaarungscreme. Die Zufuhr von Inhalationsisofluoran bis zur Herzfrequenz wird bei 400 bis 500 Schlägen pro Minute gehalten. Befestigen Sie die Gliedmaßen und den Schwanz der Maus mit Klebeband an der Erkennungskonsole und stellen Sie die Plattformtemperatur auf 37 Grad Celsius ein.
Tragen Sie das Ultraschallgelee auf den Oberbauch auf. Erhalten Sie mit einer hochauflösenden veterinärmedizinischen Ultraschallsonde Bilder der Mausleber. Ziehen Sie mit einer Fünf-Mikroliter-Mikrospritze ca. 3 x 10 zu den 5. hiPSC-CMs.
Halten Sie die Spritze fest und führen Sie eine drei Millimeter lange Nadel in den linken Paraxiphoid-Prozess ein. Folgen Sie unter Ultraschallkontrolle der Oberkante der Membran. Beobachten Sie den Atemrhythmus und die Reichweite.
Betreten Sie das Perikard am Ende des Exspirationskreises, um Schäden an Leber und Lunge zu vermeiden. Erfassen Sie dann das parasternale Langachsenbild des Mausherzens durch B-Mode-Echokardiographie. Unter Ultraschallkontrolle injizieren Sie 1 x 10 in die 5. hiPSC-CMs-Zellen in jeden der drei Randbereiche der Infarktstelle.
Entfernen Sie die Ultraschallsonde und spülen Sie das Gelee ab. Entwöhnen Sie die Maus von der Anästhesie und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Injizieren Sie Ciclosporin A kontinuierlich für einen Monat nach der Transplantation.
Das Echokardiogramm des linken Ventrikels zeigte, dass die Verletzungen aufgrund eines Myokardinfarkts in der Mehrfachdosisgruppe rückgängig gemacht wurden. Die Transplantation von hiPSC-CMs führte auch zu einer erhöhten Ejektionsfraktion und Fraktionsverkürzung. Die Messung der kardialen Parameter mittels Sirius-Rot- und Fast-Green-Färbung zeigte, dass die Infarktgröße und der Kollagenvolumenanteil abnahmen, während die linksventrikuläre Vorderwanddicke nach der Transplantation zunahm.
Die Markierung für unspezifisches Alpha-Aktin in Grün, DAPI in Blau und humanspezifisches Troponin T in Rot zeigte das Vorhandensein von transplantierten Zellen im Infarkt- und Randinfarktbereich. Die Anzahl und der Prozentsatz der transplantierten Zellen waren in der Mehrfachdosisgruppe höher als in der Einzeldosis. 28 Tage nach dem Myokardinfarkt zeigte die Mehrfachdosisgruppe einen Anstieg der Anzahl der Zellen, die den Endothelzellmarker I-B4 exprimierten.
Die Färbung von Weizenkeim-Agglutinin und sarkomerem Alpha-Actinin auf Kardiomyozyten zeigte eine Verringerung des minimalen Faserdurchmessers. Eine geringere Anzahl tunnelpositiver Kardiomyozytenkerne in der Mehrfachdosisgruppe deutete auf eine verminderte Apoptose hin. Die PCR-Analyse wies die menschliche mitochondriale DNA nur im Herzen nach und zeigte eine spezifische Transplantation.
Achten Sie beim Einführen der Nadel darauf, dass sie zusammen mit dem oberen Zwerchfellrand und am Ende des Exspirationskreises in die Perikardhöhle eindringt, um eine Verletzung der Leber oder der Lunge zu vermeiden.
