Unser Protokoll verwendet regelmäßige Fluorophorsonden und einfache Probenvorbereitungstechniken, die die abgebildete Zelle in physiologischem Zustand halten, um hochdynamische zelluläre Prozesse und detaillierte subzelluläre Strukturen zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es uns, zelluläre Prozesse mit einer Superauflösung und unter physiologischen Bedingungen über einen längeren Zeitraum zu untersuchen, ohne auf die spezielle oder vorübergehende Auflösung zu verzichten. Beginnen Sie, indem Sie eine 12 bis 14 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Dialysemembran in kleine Stücke schneiden und die Stücke mit 100 Mikrolitern lebendzelligem Zellmedium für etwa fünf Minuten einweichen.
Während die Membranen einweichen, schneiden Sie den äußeren Ring eines 50-Milliliter-Rohrs in kleine Stücke und sterilisieren Sie die Stücke in 70% Ethanol. Für die Hodendissektion und -montage zehn zwei bis drei Tage alte anästhesierte männliche Fliegen unter einem Seziermikroskop in eine Sezierschale geben und mit einer feinen Zette die Hoden entfernen. Wenn alle Hoden gesammelt wurden, waschen Sie die Hoden zweimal in Lebendzellmedium und verteilen Sie mit einer Pipettenspitze 100 bis 150 Mikroliter Lebendzellmedium auf der vorbereiteten Glasbodenschale.
Verwenden Sie eine feine Zette, um die Fliegen hoden in die Mitte der Schüssel zu übertragen und entfernen Sie alle bis auf etwa 10 Mikroliter des Mediums. Legen Sie die vorfeuchte Membran schnell auf die Hoden und legen Sie zwei bis drei kleine Kunststoffgewichte auf die Membran. Fügen Sie sofort 100 bis 150 Mikroliter frisches Lebendzellmedium hinzu und legen Sie den Ring wieder auf die erhöhte Seite der Schüssel.
Legen Sie den Deckel wieder auf den Ring und schwenken Sie ein Stück Seidenpapier in Wasser, bevor Sie das Papier auf den Deckzettel legen. Dann decken Sie die Schüssel mit einem Deckel ab und befestigen Sie die Schüssel auf der Bühne eines hochauflösenden Mikroskops. Für die Keimbahnstammzellbildgebung öffnen Sie die Bildgebungssoftware und schalten das durchgelassene Licht ein.
Verwenden Sie das 63X-Objektiv, um sich auf das Hodengewebe zu konzentrieren und die Laser einzuschalten. Klicken Sie auf "Leben", um Keimstammzellen zu finden. Passen Sie den Fokus an und klicken Sie auf "Frame Size", um die Framegröße auf 512 x 512 und 1024 x 1024 Pixel einzustellen, und auf "Averaging", um den Framedurchschnitt auf ein oder zwei festzulegen.
Klicken Sie auf "Master Gain", um die Elektronenvervielfachungsverstärkung auf weniger als 800 einzustellen, und auf "Laser", um die Laserleistung auf 1% bis 2% einzustellen Zoomen Sie auf den Bereich oder die Zelle von Interesse, um die Bildaufnahmezeit zu reduzieren und die Fotobleiche zu reduzieren, und bestätigen Sie, dass das Bild optimal konfiguriert wurde, bevor Sie auf "Experiment starten" klicken, um die Zeitrafferbildaufnahme zu starten. Wenn die Airyscan-Erfassung nicht optimal konfiguriert ist, klicken Sie in den Abschnitten "Framegröße", "Z-Stack" und "Scanbereich" auf "Optimal" und optimieren Sie das Zeitintervall, die Anzahl der Z-Slices und die Dauer der Zeitrafferaufnahme entsprechend dem experimentellen Design und der Art der Probe. Wählen Sie nach der Bildgebung "Verarbeitung", "Batch" und "Airyscan-Verarbeitung" und wählen Sie die zu verarbeitenden Bilder aus.
Klicken Sie dann auf "Prozess ausführen", um die Bilder mit Superauflösung zu erhalten. Die Lebendzellbildgebung von Drosophila-Hoden, die Alpha-Tubulin-GFP in Keimzellen im Frühstadium mit einem konfokalen Spinnscheibenmikroskop exprimieren, ermöglicht die Visualisierung der asymmetrischen Intensität von GFP-Signalen an zwei Zentrosomen, als helleres Signal am Mutterzentrosom und als relativ schwächeres Signal an den Tochterzentrosomen. Der Helligkeitsunterschied spiegelt sich wahrscheinlich in der zeitlichen Asymmetrie der Mikrotubuli-Keimbildung wider, aber die detaillierte Morphologie und Menge der Mikrotubuli kann nicht mit der konfokalen Mikroskopie der Spinnscheibe aufgelöst werden.
Im Gegensatz dazu ermöglicht die hochauflösende Bildgebung lebender Zellen die Visualisierung und Quantifizierung der Morphologie und Anzahl von Mikrotubuli. Diese verbesserte Auflösung zeigt auch Muster asymmetrischer Mikrotubuli-Keimbildung, Dehnung und erhöhter Wechselwirkung mit der Kernmembran. Die Bildgebung von Lebendzellen ermöglicht auch die Visualisierung der asymmetrischen Kernmembraninvagination, nicht jedoch einzelner Mikrotubuli, die direkt in den Kern gelangen.
Im Gegensatz dazu ermöglicht diese Superauflösungstechnik für lebende Zellen die direkte Beobachtung dieser Ereignisse durch gleichzeitige Bildgebung sowohl der Mikrotubuli als auch der Kernlamina. Während der Metaphase können beide Schwesterzentromere mittels Spinnscheibenmikroskopie als ein Signal detektiert werden, obwohl die zentrale Bindung der Mikrotubuli nicht beobachtet werden kann. Im Gegensatz dazu ermöglicht die hochauflösende Live-Bildgebung die Visualisierung der Mikrotubuli-Zentromer-Anhaftung in der frühen Prophase.
Achten Sie darauf, eine Membran über die Hoden zu legen, um sicherzustellen, dass sie sich während der Bildgebung nicht bewegen oder schweben und um die Mikroskopeinstellungen zu optimieren, um Fotobleiche und Fototoxizität zu vermeiden. Es gibt viele Möglichkeiten, wie diese Methode angewendet werden kann, z. B. um Proteindynamik, lineare Stressung oder zelluläre Abwehrkräfte und Prozesse zu untersuchen.
