Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center, das vom NIH National Center for Research Resources (NCRR) finanziert wird, für einige der Nematodenstämme. Monoklonale Antikörper, die von H.F. Epstein entwickelt wurden, wurden aus der Developmental Studies Hybridoma Bank gewonnen, die unter der Schirmherrschaft des NICHD entwickelt und vom Department of Biology der University of Iowa gepflegt wurde. Diese Forschung wurde durch ein Stipendium der Israel Science Foundation (Stipendium Nr. 278/18) und durch ein Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie und des Ministeriums für auswärtige Angelegenheiten und internationale Zusammenarbeit, Generaldirektion für Länderförderung, Italienische Republik (Zuschuss Nr. 3-14337) unterstützt. Wir danken den Mitgliedern des Ben-Zvi-Labors für die Hilfe bei der Vorbereitung dieses Manuskripts.

1. Herstellung von Nematoden-Wachstumsmedienplatten für RNAi
<ol><li>Zu einer 1 L Flasche 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 17 g Agar und destilliertes Wasser bis 1 L und Autoklav geben.</li>
	<li>Flasche auf 55 °C abkühlen.</li>
	<li>Fügen Sie 25 ml 1 MKH2PO4, pH 6,0, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4und 1 ml Cholesterinlösung (Tabelle 1) hinzu, um Nematodenwachstumsmedien (NGM) herzustellen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml Ampicillin (100 mg/ml) und 0,5 ml 1 M IPTG(Tabelle 1)hinzu, um NGM-RNAi-Lösung herzustellen. HINWEIS: Häufig verwendete HT115(DE3) E. coli-Bakterien enthalten eine IPTG-induzierbare T7-DNA-Polymerase, die zur Exprimierung der dsRNA-kodierenden Plasmide verwendet wird. Diese Plasmide kodieren auch für die Ampicillinresistenz.</li>
	<li>Mischen Sie die warme Lösung, indem Sie die Flasche schwenken.</li>
	<li>In der Haube oder mit sterilen Verfahren die NGM-Lösung in Platten gießen oder mit einer Peristaltikpumpe die Lösung in Platten dosieren. Verwenden Sie für diesen Bildschirm 6-Well-, 12-Well-, 40-mm- oder 60-mm-Platten. Agar sollte etwa 2/3 der Plattentiefe füllen.</li>
	<li>Lassen Sie die Platten über Nacht auf der Bank bei Raumtemperatur trocknen und halten Sie die Platten bedeckt. NGM-Platten für RNAi können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.</li>
</ol>2. RNAi-Bakterien züchten und Platten aussäen
<ol><li>In der Haube oder mit sterilen Verfahren 1 ml Ampicillin (100 mg/ml) und 2,5 ml Tetracyclin (5 mg/ml)(Tabelle 1)zu einer vor autoklavierten 1 L LB-Lösung geben und mischen. HINWEIS: Häufig verwendete HT115(DE3) E. coli Bakterien sind tetracyclinresistent.</li>
	<li>In der Haube oder mit sterilen Verfahren 600 μL LB-Lösung in jeder Vertiefung in 2 ml tiefen 96-Well-sterilen Platten hinzufügen. Für die Dosierung der Medien verwenden Sie am besten eine Mehrkanalpipet.</li>
	<li>Mit sterilen Verfahren werden Vertiefungen mit HT115(DE3) E. coli-Bakterien geimpft, die mit einem dsRNA-kodierenden Plasmid transformiert wurden, das auf ein interessantes Gen oder ein leeres Plasmid abzielt, um ein Gen oder ein leeres Plasmid als Kontrolle zu kontrollieren. Decken Sie die Platten ab und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C. Bibliotheken, die aus bakteriellen Klonen bestehen, die dsRNA exprimieren, was ~ 94% der vorhergesagten C. elegans-Gene entspricht,wurden zuvor22,23 konstruiert und sind kommerziell erhältlich. Die hier verwendete Chaperon-Bibliothek wurde vom Dr. Richard Morimoto Labor26gebaut.</li>
	<li>Mit sterilen Verfahren 75, 150 oder 250 μL Bakterien auf die 12-Well-, 40-mm- und 6-Well- bzw. 60-mm-NGM-RNAi-Platten aussäen. Markieren Sie deutlich den Namen des Zielgens auf der Platte. Bakterien sollten 30-50% der Agaroberfläche bedecken und die Ränder der Platte nicht berühren.</li>
	<li>Lassen Sie die Platten mindestens 2 Tage auf der Bank bei Raumtemperatur trocknen und halten Sie die Platten bedeckt. HINWEIS: Platten können über Nacht bei 37 °C inkubiert werden. Stellen Sie sicher, dass die inneren Vertiefungen trocken sind, bevor Sie die Platten verwenden oder lagern. Für alle langfristigen Zwecke (z. B. Trocknen oder Lagern) halten Sie die Platten im Dunkeln. Getrocknete, ausgesäte Platten können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.</li>
</ol>3. Stressfreie Synchronisation von Embryonen
<ol><li>Verwenden Sie einen Wurmpickel, um etwa 100 Eier von einer unsynchronisierten Wurmplatte auf eine neu ausgesäte NGM-Platte zu bewegen.</li>
	<li>Tiere 5 Tage bei 15 °C, 3,5 Tage bei 20 °C oder 2,5 Tage bei 25 °C kultivieren. Tiere sollten den ersten Tag der Eiablage erreichen. HINWEIS: Würmer werden üblicherweise bei 20 °C kultiviert. Verschiedene Chaperon-Mutantenstämme können jedoch spezifische Kultivierungstemperaturen erfordern. Zum Beispiel werden viele temperaturempfindliche Stämme bei 15 °C kultiviert, aber auf 25 °C verschoben, um ihren Phänotyp freizulegen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml M9-Puffer (Tabelle 1) langsam und weg vom Bakterien rasen hinzu. Drehen Sie die Platte so, dass der Puffer die Platte vollständig bedeckt. Dann kippen Sie es zur Seite und entfernen Sie die Flüssigkeit vom Teller und waschen Sie die Tiere vom Teller. HINWEIS: Bei der Verwendung von temperaturempfindlichen Tieren oder Chaperonmutanten ist es am besten, die im Protokoll verwendeten Puffer auf der Kultivierungstemperatur der Tiere zu halten.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.3 dreimal oder bis alle Tiere vom Teller gewaschen sind.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Standard-Kunststoffspitze ein Quadrat Agar aus dem gewaschenen Teller, auf dem die Eier konzentriert sind, und legen Sie das Stück Agar auf eine neu ausgesäte NGM-Platte. HINWEIS: ~ 200 Eier sind erforderlich, um genügend eierlegende Tiere zu produzieren; zu viele Tiere verbrauchen die Bakterien zu schnell. Niedrige Nahrungswerte können die Proteostase beeinflussen27.</li>
	<li>Kultivieren Sie die Tiere für 5 Tage bei 15 °C, 3,5 Tage bei 20 °C oder 2,5 Tage bei 25 °C. An dieser Stelle sollten die Platten mit synchronisierten Eiern bedeckt werden. HINWEIS: Tiere können für kurze Zeit auf eine neue Platte verschoben werden, um eine strengere Synchronisation zu erreichen. Es ist jedoch wichtig, erwachsene Erwachsene nur in den frühen Stadien der Eiablage zu verwenden, da Tiere Eier in ihrer Gebärmutter behalten können, was die Synchronisation beeinflusst.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml M9-Puffer langsam und weg vom Bakterien rasen hinzu.</li>
	<li>Drehen Sie die Platte so, dass der Puffer die Platte vollständig bedeckt. Dann kippen Sie es zur Seite und entfernen Sie die Flüssigkeit vom Teller und waschen Sie die Tiere vom Teller.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 3.7 dreimal oder bis alle Tiere vom Teller gewaschen sind.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml M9-Puffer hinzu und verwenden Sie einen Zellschaber, um die Eier von der Platte zu lösen.</li>
	<li>Sammeln Sie den M9-Puffer mit den Eiern von den Platten.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den M9-Puffer mit den Eiern bei 3.000 x g für 2 min.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie den M9-Puffer hinzu, um ein Volumen von 1 ml zu erreichen.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Eier, um alle Brocken von Eiern und Bakterien zu stören.</li>
	<li>Wiederholen Sie den in den Schritten 3.11-3.13 beschriebenen Waschvorgang fünfmal. Das Eierpellet sollte weiß erscheinen. Wenn es immer noch gelb / braun ist, wiederholen Sie die Wäsche, bis ein weißes Pellet erreicht ist. HINWEIS: Bakterien, die auf den Eiern verbleiben, können die dsRNA-exprimierenden Bakterien kontaminieren.</li>
	<li>Entfernen Sie den größten Teil des Überstands, so dass etwa 200 μL übrig bleiben. Synchronisierte Eier können für RNAi-Bildschirme verwendet werden.</li>
</ol>4. Gängige phänotypische Assays
<ol><li>Kultivierung von Tieren im Rahmen von Experimenten<ol>
<li>Legen Sie einen Tropfen von ~ 30 Eiern in die Nähe des Bakterien rasens in jede RNAi-samenete Platte. Als Referenz legen Sie auch ~ 30 Eier auf Teller, die mit leeren vektorhaltigen (L4440) Bakterien gesät sind.</li>
		<li>Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere auf NGM RNAi-gesäten Platten. Die Dauer des Experiments hängt von der Phase ab, in der die Tiere überwacht werden sollen, und von der Temperatur des Anbaus. Passen Sie die Kultivierungstemperatur an, wenn Temperaturempfindliche mutierte Tiere verwendet werden. Passen Sie die Kultivierungsdauer an, wenn entwicklungsverzögerte mutierte Tiere verwendet werden. HINWEIS: Während das Timing variieren kann, könnten die Eiablage (und der daraus resultierende schnelle Nahrungskonsum) sowie der altersabhängige Proteostsiskollaps28die Ergebnisse beeinflussen, sobald die Tiere das Erwachsenenalter erreicht haben. Es wird daher empfohlen, Tiere vor Beginn der Eiablage (Tag 1 des Erwachsenenalters) zu bewerten. Wildtyptiere erreichen dieses Stadium nach 4,5 Tagen bei 15 °C, 3 Tagen bei 20 °C oder 2 Tagen bei 25 °C.</li>
		<li>Die Anzahl der verwendeten Wiederholungen hängt von der Größe des untersuchten Gensatzes ab. Für die Chaperon-Bibliothek (97 Gene) wiederholen Sie Experimente mindestens viermal. Die Größe der Population hängt vom verwendeten Assay ab. In den hier diskutierten Verhaltenstests werden bei jeder Wiederholung >15 Tiere pro Versuchsbedingung bewertet. Daten und statistische Analysen hängen auch stark von der Art des verwendeten Assays ab. Die Daten in den hier besprochenen Assays können als Mittel ± SEM dargestellt werden.</li>
		<li>Vergleichen Sie die RNAi- und Empty Vector Control-behandelten Tiere als unabhängige Populationen. P-Werte können mit Einweg- oder Zwei-Wege-ANOVA berechnet werden, abhängig von den untersuchten Veränderungen, nämlich verschlimmernd oder lindernd allein oder beides. Bei der Untersuchung einer einzelnen RNAi-Behandlung im Vergleich zur Kontrolle können P-Werte mit einem einseitigen oder zweiseitigen Mann-Whitney-Rangsummentest berechnet werden. Abgesehen von der statistischen Signifikanz sollten Sie einen Schwellenwert für Treffer in Betracht ziehen, der auf dem Grad der Auswirkungen auf den Phänotyp basiert.</li>
	</ol></li>
	<li>Entwicklungsarrest/-verzögerung<ol>
<li>Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren vektorhaltigen Kontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.</li>
		<li>Überwachen Sie Tiere mit einem Stereomikroskop und zählen Sie die Anzahl der Larven und Erwachsenen, um den Prozentsatz der entwicklungsverzögerten Tiere zu bewerten. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren vektorhaltigen Kontrollbakterien gezüchtet wurden. Die Behandlung mit hsp-1 oder hsp-90 RNAi führt zu einem Entwicklungsstillstand von Wildtyptieren und kann als Positivkontrolle eingesetzt werden.</li>
		<li>Um den Prozentsatz der entwicklungsverzögerten Tiere im Laufe der Zeit zu bewerten, wiederholen Sie Schritt 4.2.2. HINWEIS: Wenn sich eilegende Erwachsene auf dem Teller befinden, übertragen Sie die entwicklungsverzögerten Tiere auf eine neue NGM-RNAi-Platte, die für dasselbe Zielgen markiert ist, um Verwechslungen mit Nachkommen zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Sterilität oder Mängel bei der Eiablage<ol>
<li>Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, eierlegen.</li>
		<li>Überwachen Sie Tiere mit einem Stereomikroskop und bewerten Sie den Prozentsatz der Tiere ohne sichtbare Eier in ihrer Gebärmutter. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden.</li>
		<li>Alternativ können Sie Tiere mit einem Stereomikroskop überwachen und den Prozentsatz der Tiere mit einer Gebärmutter voller Eier bewerten, definiert als EGg Laying defekter (Egl-d) Phänotyp29.</li>
	</ol></li>
	<li>Embryonale Letalität<ol>
<li>Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis die Tiere mit dem Eierlegen beginnen.</li>
		<li>~100 Eier auf einen leeren Teller geben. Verteilen Sie die Eier in Reihen, um das Zählen zu vereinfachen.</li>
		<li>Bewerten Sie den Prozentsatz der ungeschlüpften Eier auf dem Teller nach 24-48 Stunden. Vergleichen Sie als Referenz mit Eiern von Tieren, die mit leeren Vektorkontrollbakterien behandelt wurden.</li>
	</ol></li>
	<li>Lähmungstest<ol>
<li>Kultivieren Sie für Erwachsene am Tag 1 alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die mit leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.</li>
		<li>Zeichnen Sie eine Linie auf der Rückseite einer normalen NGM-Agarplatte mit einem feinen Marker.</li>
		<li>Legen Sie 5-10 Tiere auf die markierte Linie.</li>
		<li>Stellen Sie einen Timer ein und warten Sie 10 Minuten.</li>
		<li>Bewerten Sie den Prozentsatz der Tiere, die als gelähmte Würmer auf der Linie verbleiben. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden. Wildtyptiere, die mit unc-45 RNAi behandelt wurden, zeigen einen schweren Lähmungsphänotyp und können als Positivkontrolle verwendet werden. HINWEIS: Dieser Assay hebt Tiere hervor, die eine mittlere bis schwere Lähmung zeigen. Solche Tiere liegen normalerweise gerade auf dem Teller, anstatt die übliche gekrümmte Form zu präsentieren. Darüber hinaus ist ein von Bakterien befreites Pflaster um die Köpfe gelähmter Würmer sichtbar.</li>
	</ol></li>
	<li>Thrashing-Assay<ol>
<li>Kultivieren Sie alterssynchronisierte Tiere wie in Schritt 4.1, bis Tiere, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden, das Erwachsenenalter erreichen, aber bevor die Eiablage beginnt.</li>
		<li>Pipettieren Sie 100 μL M9-Puffer bei der Kultivierungstemperatur der Tiere in eine 96-Well-Platte.</li>
		<li>Legen Sie ~ 15 Würmer, einen pro Bohrung, in die M9-Pufferbrunnen.</li>
		<li>Lassen Sie die Tiere für 5 min einstellen.</li>
		<li>Untersuchen Sie jedes Tier unter dem Stereomikroskop, starten Sie einen Timer, der 15 s herunterzählt, und zählen Sie die Anzahl der Körperbiegungen, die jedes Tier in dieser Zeitspanne ausführt. Die gezählten Werte können auf Körperbiegungen pro Minute normalisiert werden. Vergleichen Sie als Referenz mit mutierten Tieren, die auf leeren Vektorkontrollbakterien gezüchtet wurden. HINWEIS: Dieser Motilitätstest ist sehr empfindlich und kann sehr leichte Unterschiede zwischen den Behandlungen erkennen. Die Motilität in der Flüssigkeit und die Motilität auf Agar können sich jedoch unterscheiden.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Validierung des Protein-Knockdowns
<ol><li>250-300 synchronisierte Eier werden auf eine 60 mm NGM-RNAi-Platte gesetzt, die mit den relevanten dsRNA-exprimierenden oder leeren vektorhaltigen (L4440) Bakterien gesät ist. HINWEIS: RNAi-Knockdown könnte zu einer aberranten Ansammlung von Embryonen, zu einem Mangel an Embryonen oder zu einem Entwicklungsstillstand führen, der die Genexpression beeinträchtigen könnte. Dies sollte bei der Bestimmung des Alters der zu untersuchenden Tiere berücksichtigt werden.</li>
	<li>Für Erwachsene am 1. Tag 4,5 Tage bei 15 °C, 3 Tage bei 20 °C oder 2 Tage bei 25 °C kultivieren.</li>
	<li>Insgesamt 200 junge erwachsene Tiere pflücken und in die Kappe einer 1,5 mL Röhrchenfüllung mit 200 μL PBS-T geben. HINWEIS: Bei der Verwendung von temperaturempfindlichen Tieren oder Chaperonmutanten ist es am besten, die im Protokoll verwendeten Puffer auf der Kultivierungstemperatur der Tiere zu halten.</li>
	<li>Schließen Sie die Kappe vorsichtig und zentrifugieren Sie bei 1.000 x g für 1 min.</li>
	<li>800 μL PBS-T (Tabelle 1) hinzufügen und bei 1.000 x g zentrifugieren für 1 min.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die oberen 900 μL.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.6 dreimal.</li>
	<li>900 μL entfernen, wobei 100 μL Lösung mit den 200 Würmern übrig bleiben.</li>
	<li>Fügen Sie 25 μL 5x Probenpuffer hinzu (Tabelle 1).</li>
	<li>Erhitzen Sie die Proben für 10 min bei 92°C beim Schütteln bei 1000 U/min. Die Proben können dann eingefroren und bei -20 °C aufbewahrt werden.</li>
	<li>Laden Sie 20 μL jeder Probe und führen Sie sie mit einem SDS-PAGE-Gel aus.</li>
	<li>Führen Sie eine Western-Blot-Analyse mit geeigneten Antikörpern durch, um die relative Stabilität des Proteins zu bestimmen.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Intensität der Bänder mit einer densitometrischen Software, wie z.B. dem frei verfügbaren ImageJ Gelmodul. Normalisieren Sie alle Werte auf die in der/den Kontrollprobe(n) gemessenen Werte. HINWEIS: Das Ziel des RNAi-Knockdowns in unseren Bildschirmen ist es, den Proteinspiegel eines bestimmten Chaperons / Co-Chaperons zu senken. Daher ist der beste Weg, die Effizienz des RNAi-Knockdowns zu bewerten, die Western-Blot-Analyse. Dies erfordert spezifische Antikörper. Alternativ kann qPCR verwendet werden, um mRNA-Spiegel zu quantifizieren.</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Ein integriertes Bild des Proteostase-Netzwerks, das widerspiegelt, wie es in verschiedenen Metazoenzellen und -geweben organisiert ist und funktioniert, fehlt weiterhin. Um dieses Manko zu beheben, sind spezifische Informationen über die Wechselwirkungen verschiedener Komponenten dieses Netzwerks, wie z.B. molekulare Chaperone, in bestimmten Geweben im Laufe der Entwicklung und Alterung erforderlich. Hier zeigten wir, wie die Verwendung von gewebespezifischen Störungen es uns ermöglichte, das Chaperonnetzwerk in eine...

Zellen bewältigen Proteinschäden durch den Einsatz von Qualitätskontrollmaschinen, die beschädigte Proteine reparieren, sequestrieren oder entfernen1,2. Die Faltung und Montage von Proteinkomplexen wird durch molekulare Chaperone unterstützt, eine vielfältige Gruppe hochkonservierter Proteine, die beschädigte Proteine reparieren oder sequestrieren können3,4,5,6,7. Die Entfernung geschädigter Proteine wird durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS)8 oder durch die Autophagie-Maschinerie9 in Zusammenarbeit mit den Chaperonen10,11,12vermittelt. Die Protein-Homöostase (Proteostase) wird daher durch Qualitätskontrollnetzwerke aufrechterhalten, die aus Falt- und Abbaumaschinen bestehen3,13. Die Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Komponenten des Proteostase-Netzwerks in vivo zu verstehen, ist jedoch eine große Herausforderung. Während Protein-Protein-Interaktionsscreens wichtige Informationen über physikalische Interaktionen und Chaperonkomplexe14,15beisteuern, fehlt es an einem Verständnis der Organisation und der kompensatorischen Mechanismen innerhalb gewebespezifischer Chaperonnetzwerke in vivo.
Genetische Interaktionen werden oft als leistungsfähiges Werkzeug verwendet, um die Beziehung zwischen Genpaaren zu untersuchen, die an gemeinsamen oder kompensatorischen biologischen Signalwegen beteiligt sind16,17,18. Solche Beziehungen können gemessen werden, indem Mutationspaare kombiniert und der Einfluss einer Mutation in einem Gen auf den phänotypischen Schweregrad, der durch eine Mutation im zweiten Gen verursacht wird, quantifiziertwird 16. Während die meisten dieser Kombinationen keine Wirkung in Bezug auf den Phänotyp zeigen, können einige genetische Interaktionen die Schwere des gemessenen Phänotyps entweder verschlimmern oder lindern. Erschwerende Mutationen werden beobachtet, wenn der Phänotyp der Doppelslektionsmutante schwerwiegender ist als der erwartete Phänotyp, der bei der Kombination der einzelnen Deletionsmutanten beobachtet wird, was bedeutet, dass die beiden Gene in parallelen Signalwegen funktionieren und zusammen eine bestimmte Funktion beeinflussen. Im Gegensatz dazu werden lindernde Mutationen beobachtet, wenn der Phänotyp der Doppelsleerationsmutante weniger schwerwiegend ist als der Phänotyp, der bei den Einzelnen Deletionsmutanten beobachtet wurde, was bedeutet, dass die beiden Gene zusammen als Komplex wirken oder am gleichen Weg teilnehmen16,18. Dementsprechend wurden verschiedene Phänotypen, die quantifiziert werden können, einschließlich breiter Phänotypen wie Letalität, Wachstumsraten und Brutgröße, sowie spezifischer Phänotypen wie Transkriptionsreporter verwendet, um genetische Interaktionen zu identifizieren. Zum Beispiel stützten sich Jonikas et al. auf einen ER-Stressreporter, um die Interaktionen des Saccharomyces cerevisiae ER entfalteten Proteinantwort-Proteostase-Netzwerks mit paarweisen Gen-Deletionsanalysen zu untersuchen19.
Genetische Interaktionsscreens beinhalten die systematische Kreuzung paarweiser Deletionsmutationen, um einen umfassenden Satz von Doppelmutanten zu erzeugen20. In Tiermodellen und speziell bei C. elegansist dieser groß angelegte Ansatz jedoch nicht durchführbar. Stattdessen können mutierte Stämme auf ihre genetischen Interaktionsmuster getestet werden, indem die Genexpression mithilfe von RNA-Interferenz (RNAi) herunterreguliert wird21. C. elegans ist ein leistungsfähiges System für Bildschirme auf Basis von RNAi22,23. Bei C. eleganswird die doppelsträngige RNA-Abgabe (dsRNA) durch bakterielle Fütterung erreicht, was zur Ausbreitung von dsRNA-Molekülen auf zahlreiche Gewebe führt. Auf diese Weise wirken die eingebrachten dsRNA-Moleküle über ein schnelles und einfaches Verfahren auf das Tier21. Ein genetisches Interaktionsscreening mit RNAi kann daher die Auswirkungen der Downregulierung einer Reihe von Genen oder der meisten C. elegans-kodierenden Gene unter Verwendung von RNAi-Bibliothekenaufdecken 24. In einem solchen Bildschirm sind Treffer, die das Verhalten der mutanten von Interesse beeinflussen, aber nicht des Wildtypstamms, potenzielle Modifikatoren des zu überwachenden Phänotyps25. Hier wenden wir eine Kombination aus Mutationen und RNAi-Screening an, um gewebespezifische Chaperon-Interaktionen bei C. elegans systematisch abzubilden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well-plates</td>
			<td>SPL</td>
			<td>BA3D16B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>627160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm plates</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well 2 mL 128.0/85mm</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>780278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>AGA03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>69-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BO126-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.02382.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Qimaging</td>
			<td>q30548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0433-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SCGPUO2RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Frutarom</td>
			<td>2355519000024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Formedium</td>
			<td>367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001649029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22189-08-8</td>
			<td>Gift from the Morimoto laboratory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myosin MHC A (MYO-3) antibody</td>
			<td>Hybridoma Bank</td>
			<td>5-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;7H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>s-0751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>001903029100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>61930705001730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate pouring pump</td>
			<td>Integra</td>
			<td>does it p920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAi Chaperone library</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0837-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#223;-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio world</td>
			<td>41300000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetracycline</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>64-75-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Bio-Lab</td>
			<td>002009239100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions

Die korrekte Faltung und Montage von Proteinen und Proteinkomplexen ist für die Zellfunktion unerlässlich. Zellen verwenden Qualitätskontrollwege, die beschädigte Proteine korrigieren, sequestrieren oder eliminieren, um ein gesundes Proteom zu erhalten, wodurch die zelluläre Proteostase sichergestellt und weitere Proteinschäden verhindert werden. Aufgrund redundanter Funktionen innerhalb des Proteostase-Netzwerks führt das Screening auf nachweisbare Phänotypen mittels Knockdown oder Mutationen in Chaperon-kodierenden Genen im Vielzellorganismus Caenorhabditis elegans in den meisten Fällen zum Nachweis von geringfügigen oder keinen Phänotypen. Wir haben eine gezielte Screening-Strategie entwickelt, um Chaperone zu identifizieren, die für eine bestimmte Funktion benötigt werden, und so die Lücke zwischen Phänotyp und Funktion zu schließen. Insbesondere überwachen wir neuartige Chaperon-Interaktionen mit RNAi-synthetischen Interaktionsbildschirmen, die die Chaperonexpression nacheinander bei Tieren niederschlagen, die eine Mutation in einem Chaperon-kodierenden Gen tragen oder ein Chaperon von Interesse überexpressieren. Indem wir zwei Chaperone stören, die einzeln keinen groben Phänotyp aufweisen, können wir Chaperone identifizieren, die einen bestimmten Phänotyp verschlimmern oder freilegen, wenn beide gestört sind. Wir zeigen, dass dieser Ansatz bestimmte Gruppen von Chaperonen identifizieren kann, die zusammen funktionieren, um die Faltung eines Proteins oder von Proteinkomplexen zu modulieren, die mit einem bestimmten Phänotyp assoziiert sind.

Verwendung temperaturempfindlicher Mutationen in UNC-45 zum Screening auf verschlimmernde oder lindernde Wechselwirkungen unter freizügigen bzw. restriktiven Bedingungen Muskelaufbau und -erhaltung bieten ein effektives System zur Untersuchung gewebespezifischer Chaperon-Interaktionen. Die Funktionelle Einheit der kontraktilen Muskeln, das Sarkomer, stellt eine kristalline Anordnung von strukturellen und regulatorischen Proteinen dar. Die Stabilität des Motorproteins Myosin und sein Einbau in die di...

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Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.

Verwendung von Caenorhabditis elegans zum Screening auf gewebespezifische Chaperon-Interaktionen

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

using-caenorhabditis-elegans-to-screen-for-tissue-specific-chaperone

Research

JoVE Journal

Biology

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

2.8K Aufrufe.  Ben-Gurion University of the Negev. Um Chaperon-Chaperon- und Chaperon-Substrat-Interaktionen zu untersuchen, führen wir synthetische Interaktionsscreens bei Caenorhabditis elegans mit RNA-Interferenz in Kombination mit leichten Mutationen oder Überexpression von Chaperonen durch und überwachen gewebespezifische Proteindysfunktion auf organismischer Ebene.

Serie: Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Forschung

Biologie

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

Nahrungsergänzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Ein screenbaren<em&gt; In-vivo-</em&gt; Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Methoden zur Untersuchung Veränderungen inhärenten Proteinaggregation mit dem Alter in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Quantifizierung des gewebespezifischen proteostatischen Rückgangs bei Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

Modellierung altersassoziierter neurodegenerativer Erkrankungen bei Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Quantifizierung der Mitophagie in C. elegans und einer Leberkrebszelllinie

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Autor im Rampenlicht: Nachweis der Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...