Die Autoren danken den Züchtern und dem Verein Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Frankreich) für die Lieferung von befruchteten Eiern. Diese Studie wurde unter der Schirmherrschaft des Forschungskonsortiums APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019) durchgeführt, das vom Région Centre Val de Loire, Frankreich, finanziert wurde.

Die Tierpflegeverfahren wurden gemäß den Leitlinien der Richtlinie 86/609/EWG des Rates der Europäischen Gemeinschaften und der französischen Tierversuchsverordnung durchgeführt.
1. Isolator-Vorbereitung
<ol><li>Legen Sie die erforderlichen Materialien unter Überdruck in einen starren Isolator ein: 50 ml Röhrchen, 5, 10 und 25 ml Kunststoffpipetten, bestrahltes Futter, autoklaviertes Wasser und steril verschlossene Kunststoffbehälter.</li>
	<li>Füllen Sie die keimtötende Transferfalle mit einer 2% igen quartären Ammoniumlösung.</li>
	<li>Sterilisieren Sie den Isolator dreimal mit Formaldehyddampf, indem Sie 60 ml Formalin (24% Formaldehyd) zu 30 g Kaliumpermanganat pro Kubikmeter (m3) hinzufügen. Bewegen Sie die Materialien im Inneren des Isolators zwischen den einzelnen Sterilisationen, um die Sterilisation aller Kontaktflächen sicherzustellen.</li>
	<li>Stellen Sie die Isolatortemperatur für mindestens 2 Tage auf 37 °C ein, bevor die Eier eingeführt werden. Stellen Sie das Hygrometer am Tag der Einführung auf 65-70% der relativen Luftfeuchtigkeit (RH) ein.</li>
</ol>2. Eizellentnahme und -inkubation
<ol><li>Sammeln Sie die Eier von Betrieben, die auf der Grundlage einer guten Schlupfrate der Legehennen (mindestens 80% auf dem Höhepunkt der Eierproduktion) und ihres guten Gesundheitszustands (d. h. Fehlen von Geflügelpathogenen und Fehlen von Krankheiten innerhalb der Herde) ausgewählt wurden. Wählen Sie auf dem Laufband optisch saubere und makellose Eier aus.</li>
	<li>Dekontaminieren Sie sofort die Eioberfläche, indem Sie sie für 5 Minuten in eine 1,5% ige Peressigsäurelösung bei Raumtemperatur tauchen.</li>
	<li>Transportieren Sie die Eier mit einer mit Formaldehyddampf dekontaminierten Box zur Versuchsanlage.</li>
	<li>Lagern Sie die Eier 24 Stunden bei 4 °C. Wiederholen Sie den in Schritt 2.2 beschriebenen Dekontaminationsvorgang, und legen Sie sie 19 Tage lang in einen Brutkasten (Tag 0).</li>
</ol>3. Schraffur
<ol><li>Überprüfen Sie am 19. Tag die Fruchtbarkeit, die Lebensfähigkeit (Motilität) und die Embryonalentwicklung, indem Sie sie mit einem hellen Eierkerzen unter sterilen Bedingungen kandieren. Geben Sie nur lebende embryonierte Eier in die sterilen Brutisolatoren ein.</li>
	<li>Dekontaminieren Sie die ausgewählten Eier, indem Sie 1,5% ige Peressigsäurelösung für 30 s sprühen oder bis die gesamte Oberfläche jedes Eies bedeckt ist. Die Eier bleiben während des Transfers in Isolatoren 16 Minuten und 30 s in Kontakt mit dem Spray.</li>
	<li>Übertragen Sie die Eier in die sterilen Schlupfisolatoren und spülen Sie sie mit sterilem demineralisiertem Wasser ab, bevor Sie sie in den Schlupfraum legen. HINWEIS: Die Tiere werden in sterilen Isolatoren geschlüpft und aufgezogen. Sie werden ad libitum mit einer kommerziellen Diät gefüttert, die durch Gammabestrahlung sterilisiert und mit autoklaviertem Leitungswasser bewässert wird, das von Wasserspendern bereitgestellt wird.</li>
</ol>4. Bakteriologische Zustandsanalyse
<ol><li>Nehmen Sie einen Tag nach dem Schlüpfen eine Stuhlprobe direkt aus dem Rektum verschiedener Küken und sammeln Sie sie in einem sterilisierten Glasröhrchen, um diese Probe repräsentativ für alle Tiere in einem bestimmten Isolator zu machen.</li>
	<li>Da die Stuhlproben mehr oder weniger flüssig sind, fügen Sie ein Äquivalent von 1 ml Stuhl zu 9 ml Thioglycolatbrühe mit Resazurin hinzu. Fügen Sie die verbleibende Stuhlprobe zu 9 ml Hirnherzinfusionsbrühe (BHI) hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 ° C ohne Schütteln für 18 bis 48 h. Dies wird das Wachstum einer breiten Palette von aeroben, fakultativen aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Arten ermöglichen. HINWEIS: Thioglycolatbrühe mit Resazurin ist für den Nachweis von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien vorgesehen, ermöglicht aber auch den Nachweis von aeroben Bakterien. Dieses Medium entspricht den europäischen, amerikanischen und japanischen Arzneibüchern für Sterilitätstests18,19,20.</li>
	<li>Beobachten Sie visuell, ob nach 18 Stunden Inkubation eine Veränderung in den Wachstumsmedien auftritt. Nach 48 h nehmen Sie einen Tropfen aus dem BHI-Stuhlbrühemedium, legen Sie es auf einen Glasobjektträger und beobachten Sie unter einem Mikroskop (40-fache Vergrößerung) die Abwesenheit oder Anwesenheit von Bakterien.</li>
	<li>Wenn der Verdacht auf das Vorhandensein von Bakterien besteht, nehmen Sie eine Probe aus der BHI-Kultur und säen Sie sie auf BHI-Agarplatten aus. Bei 37 °C für 18 bis 48 h inkubieren.</li>
	<li>Wenn Kolonien vorhanden sind, führen Sie Hochdurchsatztechniken wie die MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur präzisen mikrobiellen Identifizierung durch. HINWEIS: Nach 72 h, wenn die bakteriologischen Analysen negativ sind, werden die Tiere für keimfrei erklärt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+microbiota:+importance+and+detection+echnology.">Chicken microbiota: importance and detection echnology.</a> Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).</li><li>Grover, M., Kashyap, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+mice+as+a+model+to+study+effect+of+gut+microbiota+on+host+physiology.">Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 26 (6), 745-748 (2014).</li><li>Umesaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gnotobiotic+mice+to+identify+and+characterize+key+microbes+responsible+for+the+development+of+the+intestinal+immune+system.">Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system.</a> Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).</li><li>Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fern&#225;ndez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota,+gut+health+and+chicken+productivity:+what+is+the+connection?.">Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection?.</a> Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microbial+communities+in+the+chicken+oviduct+and+the+origin+of+chicken+embryo+gut+microbiota.">Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota.</a> International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).</li><li>Hincke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+structural+barriers+and+innate+immune+components+during+incubation+of+the+avian+egg:+critical+interplay+between+autonomous+embryonic+development+and+maternal+anticipation.">Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation.</a> Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).</li><li>Le Bars, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+protocol+for+obtaining+germ-free+chickens.">Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens.</a> Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).</li><li>Lafont, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+some+factors+limiting+'competitive+exclusion'+of+Salmonella+in+chickens.">Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens.</a> Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).</li><li>Br&#233;e, A., Dho, M., Lafont, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+infectivity+for+axenic+and+specific-pathogen-free+chickens+of+O2+Escherichia+coli+strains+with+or+without+virulence+factors.">Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors.</a> Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).</li><li>Dozois, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+and+in+vivo+expression+of+F1+(type+1)+fimbrial+antigens+in+chickens+experimentally+infected+with+pathogenic+Escherichia+coli.">Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli.</a> Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).</li><li>Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+island+of+an+extraintestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain+enables+the+metabolism+of+fructooligosaccharides,+which+improves+intestinal+colonization.">A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).</li><li>Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Br&#233;e, A., Schouler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fructooligosaccharide+metabolism+on+chicken+colonization+by+an+extra-intestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain.">Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain.</a> PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).</li><li>Kraimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+gut+microbiota+transfer+on+emotional+reactivity+in+Japanese+quails+(Coturnix+japonica).">Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica).</a> of Experimental Biology. 222, (2019).</li><li>Stanley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+associated+with+differential+feed+conversion+efficiency+in+chickens.">Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens.</a> Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).</li><li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+gut+microbiota+composition+on+Campylobacter+jejuni+colonization+in+chickens.">Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).</li><li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbial+dynamics+during+conventionalization+of+germ-free+chicken.">Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken.</a> mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).</li><li>Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+viscosity+on+digestion+of+nutrients+in+conventional+and+germ-free+chicks.">Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks.</a> British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).</li><li>European Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , (2009).</li><li>Japanese Pharmacopoeia, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , (2009).</li><li>United States Pharmacopeia (USP). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), (2008).</li><li>Harrison, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-free+chicks:+a+comparison+of+the+hatchability+of+eggs+sterilized+externally+by+different+methods.">Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods.</a> Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).</li><li>Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+production+and+rearing+of+the+germ-free+chick.">A simple method for production and rearing of the germ-free chick.</a> J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+and+establishment+of+gut+microbiota+in+chickens.">Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mehrere Methoden zur Erzeugung keimfreier Hühner wurden zuvor beschrieben 7,21,22. Einfache Methoden, wie die hier vorgestellte, verwenden verschiedene Desinfektionsmittel, um die Keimbelastung in der Eioberfläche und in den Isolatoren zu reduzieren. Die am häufigsten verwendeten Desinfektionsmittel sind Quecksilberchlorid, quartäres Ammonium, Jodform, Natriumhypochlorit und Chlordioxidlösungen. Die Ergebnisse sind oft zufriedenstellend. Trotz der Zugänglichkeit dieser Methoden können jedoch nur wenige Strukturen die Methode anwenden und die Tiere in großem Maßstab aufziehen, was die Verwendung keimfreier Hühner zu einem relativ seltenen Ansatz macht, der nur zur Beantwortung sehr spezifischer wissenschaftlicher Fragen verwendet wird. Die hier beschriebenen Methoden, Materialien und Geräte ermöglichen einen hocheffizienten Schlüpfanteil keimfreier Masthähnchen, die mindestens 3 Wochen (die Dauer der wissenschaftlichen Experimente, zu denen sie hergestellt wurden) gesund und steril bleiben.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Anpassung des Protokolls an die Produktion keimfreier Küken aus Eiern, die in kommerziellen Geflügelfarmen gesammelt wurden, erfolgreich ist. Die Erfahrung mit der SPF-Eierproduktion zeigt, dass die Schlupfeffizienz in erster Linie vom Alter der Legehennen und von der Qualität der gesammelten Eier abhängt. Beide Parameter wurden bei der Auswahl der Betriebe und der Sammlung der Eier berücksichtigt. Mit der gleichen Methode ist die durchschnittliche Schlüpfrate von keimfreien Masthähnchen viel besser als bei der letzten Produktion von SPF-Legehennen in unserer Anlage (79% gegenüber 35%), ohne die Tiersterilität zu beeinträchtigen (87% vs. 83%). Diese Unterschiede können mit dem genetischen Hintergrund der Vögel (Masthähnchen versus Schichten) sowie mit der Qualität der Eierschale zusammenhängen, die in den Eiern der SPF-Tiere, die seit mehr als 40 Jahren in geschlossener Zucht gehalten werden, anfälliger ist. Darüber hinaus zeigen wir auch, dass der Transport von mehr als 2 h (von den Farmen zur Versuchsanlage) die Schlupfeffizienz und -qualität nicht beeinträchtigt.
Obwohl der Sterilisationsprozess für Schlüpfisolatoren und das Protokoll für die Eizelldekontamination optimiert wurden, waren rund 10% der Isolatoren nicht keimfrei. Um den Ursprung der Kontamination zu verstehen, ist es sehr wichtig, eine routinemäßige Sterilitätskontrolle der geschlüpften Isolatoren vor der Eieinführung durchzuführen.
In Bezug auf den Sterilitätsstatus der Vögel haben wir versucht, Methoden anzuwenden, die das Wachstum von aeroben und nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien aus Stuhlproben ermöglichen und so sicherstellen, dass wir lebende, lebensfähige Bakterien nachweisen. Diese Methoden entsprechen den internationalen Arzneibüchern für Sterilitätstests und stellen schnelle, einfache und kostenreduzierte Techniken dar, die routinemäßig angewendet werden können. Molekularbiologische Techniken wie die 16S rRNA-Gensequenzierung geben zwar keine Informationen über die Lebensfähigkeit von Bakterien, können jedoch zur Bestätigung des Vorhandenseins nicht kultivierbarer Bakterien eingesetzt werden. Tatsächlich deutete eine kürzlich durchgeführte Studie darauf hin, dass einige Bakterien der mütterlichen Eileitermikrobiota durch das Eiweiß auf den Embryo übertragen zu werden scheinen und später den größten Teil der embryonalen Darmbakterienpopulationausmachen 5. Darüber hinaus deutete eine andere Studie darauf hin, dass ein Teil der mikrobiellen Kolonisatoren, die in frühen Embryonen untergebracht waren, von mütterlichen Hühnern vererbt wurden und die mikrobielle Häufigkeit und Vielfalt des Darms später durch Umweltfaktoren und Wirtsgenetik während der Entwicklungbeeinflusst wurden 23. Die Ergebnisse dieser Studien basieren jedoch auf DNA-Sequenzanalysen, bei denen eine große Anzahl dieser Bakterien im Eiweiß (stark mit antimikrobiellen Molekülen beladen) tot oder nicht replizierbar sein könnte. Thomas und seine Mitarbeiter16 führten Sterilitätstests durch die Bewertung kultivierbarer aerober und fakultativer aerober Bakterien durch fäkales Abtropfen auf BHI-Platten durch und hoben so die Effizienz der bakteriologischen Standardmethoden zur keimfreien Sterilitätskontrolle hervor. Darüber hinaus haben wir in dem vorgeschlagenen Protokoll die Wachstumsüberwachung in Thioglycolatbrühe mit Resazurin verwendet, um das Wachstum von nicht anspruchsvollen anaeroben Bakterien nachweisen zu können.
Das Protokoll, das bereits für die Produktion von keimfreien Wachteln und Hühnern verwendet wird, ist an die Produktion von keimfreien Tieren aus den meisten Brutvögeln anpassbar und bietet Perspektiven für die Untersuchung des Beitrags der Mikrobiota zur Physiologie dieser Tiere. Neben der Verwendung dieses Modells zur Untersuchung gegenseitiger Interaktionen zwischen Wirt und Mikrobiota im Geflügeldarm könnte es auch für die angewandte Forschung nützlich sein. Zum Beispiel könnte es verwendet werden, um die Sicherheit und Wirksamkeit von Probiotika aus Hühnerdarm-kommensalen Mikroorganismen zu bewerten, um die Gesundheit und Robustheit der Tiere zu verbessern.

Das wissenschaftliche und populäre Interesse am Beitrag der Darmmikrobiota zur Tiergesundheit hat dramatisch zugenommen. Die Mikrobiota, bestehend aus Bakterien, Viren, Pilzen und Archaeen, die verschiedene Nischen im Darm des Tieres bewohnen, ist direkt oder indirekt an der Regulation von entzündlichen, infektiösen und metabolischen Erkrankungen beteiligt, die nicht nur Säugetierarten, sondern auch Nutztiere wie Geflügelbetreffen 1. Mehrere Tiermodelle wurden entwickelt, um den Beitrag der Darmmikrobiota zu Gesundheit und Krankheit besser untersuchen zu können. Zum Beispiel ermöglichen keimfreie und gnotobiotische Tiere die Untersuchung der vollständigen Abwesenheit von Mikroben bzw. einer bekannten Mikrobiota auf die Physiopathologie von Infektionen 2,3. Die Erzeugung und Pflege dieser Tiere erfordert jedoch spezielle Techniken und Einrichtungen, und die Kosten, die Arbeit und die Fähigkeiten, die erforderlich sind, um sie zu erhalten, beschränken ihren Zugang zu vielen Forschern. Tatsächlich müssen keimfreie Tiere regelmäßig auf eine mögliche Kontamination mit einer Kombination aus Bakterienkultivierungsmethoden, Mikroskopie, Serologie, grober Morphologie und sequenzierungsbasierten Nachweistechniken überwacht werden. Ähnliche Verfahren gelten auch für andere Arten wie Nutztiere, bei denen Tiere im Allgemeinen größer sind und größere Einrichtungen für ihre Zucht und Pflege benötigen, was die Erforschung der Mikrobiota bis zu einem gewissen Grad behindern kann.
Geflügel, genauer gesagt Hühner, sind der Eckpfeiler der weltweiten Tierproduktion, mit einer Herdenpopulation, die 40 Milliarden Vögel pro Jahr überschreiten kann. Es ist die wichtigste Quelle für tierisches Protein in der Welt (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Darüber hinaus gibt es keine kulturellen oder religiösen Tabus, die mit der Aufzucht oder dem Verzehr von Hühnern verbunden sind. Die Geflügeldarmmikrobiota ist wichtig am Wachstum der Tiere, am Futterverwertungsverhältnis, an der Immunität, an der Resistenz gegen Krankheitserreger und an vielen anderen ernährungsphysiologischen, physiologischen oder pathologischen Prozessenbeteiligt 4. Die Erzeugung keimfreier Hühner ist daher unerlässlich, um den Dialog zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt zu unterstreichen4. Selbst wenn mikrobielle Gemeinschaften den Huhneileiter5 bewohnen, ist der Inhalt eines Eies, das von einer gesunden Henne frisch gelegt wurde, meist frei von Mikroorganismen, wobei die Eierschale und die Membranen mechanische Barrieren besitzen, um eine Invasion von Mikroorganismen zu vermeiden4. Darüber hinaus werden Küken in Abwesenheit ihrer Verwandten leicht aufgezogen, was im Gegensatz zu Säugetieren die Produktion keimfreier Tiere ohne elterliche Aufzucht unter sterilen Bedingungen ermöglicht.
Die Versuchsanlage "Infektiologie von Nutztieren, Modellen und Wildtieren" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Frankreich, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) ist Teil des französischen nationalen Infrastrukturnetzes EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE beherrscht die Produktion von keimfreien Hühnern, um seit mehr als 40 Jahren verschiedene experimentelle Studien durchzuführen 7,8,9,10,11. Diese Tiere wurden aus spezifischen pathogenfreien (SPF) Eiern einer weißen Leghorn-Legelinie hergestellt, die seit den 1970er Jahren in geschlossener Zucht gezüchtet wurde. Hauptsächlich für mikrobiologische Studien verwendet 7,8,9, erleben keimfreie Vögel ein Wiederaufleben des Interesses mit Fragen wie dem Beitrag der Darmmikrobiota zum Verhalten 13, Nährstoffverwertung 14, Immunentwicklung 15 und endokriner Aktivität. Auch wenn einige Studien mit keimfreien Masthähnchenlinien16 veröffentlicht wurden, bleiben diese Studien im Vergleich zu Studien mit experimentellen Schichtlinien unterrepräsentiert. Die Entwicklung wissenschaftlicher Fragen hin zum Crosstalk zwischen der Mikrobiota und ihrem Wirt in Bezug auf Geflügelgesundheit und -wohlergehen hat uns dazu veranlasst, unser historisches Protokoll anzupassen, um keimfreie Masthähnchen der Ross PM3-Linie, der weltweit am häufigsten verwendeten Masthähnchenlinie, herzustellen.

<table><tbody><tr><td>2 mL sterile plastic pipettes</td><td>Starsted</td><td>86.1252.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI agar plates</td><td>Thermo fisher diagnostic</td><td>PO1198A</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion broth</td><td>Thermo fisher diagnostic</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes with 9 mL BHI broth</td><td></td><td></td><td>home made and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td><td></td><td></td><td>home made and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Hatching incubator</td><td>Fieme</td><td>MG 576</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td></td><td>for bacteriological culture, 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Irradiated feed</td><td>Safe</td><td>U8983G10R</td><td>40 kG irradiated</td></tr><tr><td>Isolators</td><td></td><td></td><td>home made. 1 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; rigid isolator under positive pressure</td></tr><tr><td>Microbiological safety cabinet</td><td>thermon electron corporation</td><td></td><td>model: Hera Safe</td></tr><tr><td>Microscope Visiscope series 300</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette aid</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile sealed boxes</td><td>Tuperware</td><td></td><td>diameter</td></tr><tr><td>Sterilized glass tube</td><td></td><td></td><td>&quot;sovirel&quot;</td></tr><tr><td>Thioglycolate Broth with Resazurin</td><td>Merck</td><td>90404-500G</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &amp;deg;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td></tr></tbody></table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

Untersuchungen des Beitrags der Darmmikrobiota zur Wirtsphysiologie und Immunkompetenz werden durch die Verfügbarkeit keimfreier Tiermodelle erleichtert, die als Goldstandard gelten. Nistende Vögel sind ideale Modelle für die Produktion keimfreier Tiere, da ihre Verwandten nicht unter sterilen Bedingungen aufgezogen werden müssen. Keimfreie Hühner werden hauptsächlich aus spezifisch-pathogenfreien (SPF) Versuchslinien erzeugt, die für kommerzielle Hühnerlinien schlecht repräsentativ sind. Die hier vorgeschlagene Methode ermöglichte die Produktion von keimfreien Hühnern aus der schnell wachsenden Masthähnchenlinie Ross PM3, die üblicherweise von der Geflügelindustrie verwendet wird. Die Eier wurden schnell gesammelt, nachdem sie auf einer Masthähnchenzuchtfarm gelegt worden waren. Sie durchliefen einen strengen Dekontaminationsprozess von der Entnahme bis zur Einführung in einen sterilen Eierschlüpfisolator. Die Küken wurden geschlüpft und in diesen sterilen Isolatoren während des Zeitraums gehalten, der zur Kontrolle ihrer Sterilität erforderlich ist. Ursprünglich für eine experimentelle SPF-Linie für weiße Leghorne entwickelt, wurde das vorliegende Protokoll nicht nur an die Ross PM3-Masthähnchenlinie, sondern auch an Wachteln angepasst. Es stellt daher ein robustes und leicht anpassbares Verfahren an andere Geflügelarten und Brutvögel von ökonomischer, biologischer oder ökologischer Relevanz dar.

Sechs Läufe der keimfreien Kükengeneration wurden mit Ross PM3-Eiern aus zwei verschiedenen französischen Betrieben durchgeführt (Tabelle 1). Insgesamt wurden 853 Eier gesammelt und nach zwei Dekontaminationsschritten und 19 Tagen Inkubation waren 86,40% lebensfähig. 490 dieser lebensfähigen Eier durchliefen einen dritten Dekontaminationsschritt und wurden in verschiedene Schlupfisolatoren eingeführt, was einer durchschnittlichen Schlupfrate von 79,80% entspricht. Dies entspricht einer Schlupfrate von 68,94% im Vergleich zur ursprünglichen Anzahl der gesammelten Eier.
Die Brutergebnisse variieren jedoch je nach durchgeführter Serie erheblich: von 41,67% bis 88,16% der lebensfähigen Küken im Vergleich zur Anzahl der gesammelten Eier. Diese Variationen wurden auch zwischen den verschiedenen Luken während desselben Experiments beobachtet. Da nicht alle Isolatoren für alle Durchläufe verwendet wurden, ist es schwierig, einen isolatorabhängigen Effekt auszuschließen. Dieser Chargeneffekt korrelierte jedoch direkt mit dem Alter der Legehennen (Abbildung 1), wo Eier von älteren Hühnern weniger lebensfähig waren.
Die sechs Läufe wurden mit vier verschiedenen Schraffurisolatoren durchgeführt. Nach bakteriologischer Kontrolle wurde bestätigt, dass die Tiere aus 14 der 16 Isolatoren keimfrei sind. Dies entspricht einer Erfolgsquote von 87,5%. Die beiden verbleibenden Isolatoren waren durch ein einziges umweltbedingtes und nichtpathogenes Bakterium kontaminiert.
Alle Tiere, die für die wissenschaftlichen Experimente verwendet wurden, blieben bis zum Ende der Studien für mindestens drei Wochen nach dem Schlüpfen keimfrei.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Einfluss des Hühneralters auf die Schlüpfrate Die vorliegende Abbildung zeigt die beobachteten Schlupfraten auf der Grundlage des Alters der Legehennenherde, ausgedrückt in Wochen des Legens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Gesammelte Eier</td>
			<td>D19 lebensfähige Eier</td>
			<td>D19 lebensfähige Eier/gesammelte Eier</td>
			<td>Eier, die in Isolator 1 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 2 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 3 überführt werden</td>
			<td>Eier, die in Isolator 4 überführt werden</td>
			<td>Gesamtzahl der übertragenen Eier</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 1 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 2 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 3 geschlüpft sind</td>
			<td>lebensfähige Küken, die in Isolator 4 geschlüpft sind</td>
			<td>Gesamtzahl der lebensfähigen geschlüpften Küken</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier1</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier2</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier3</td>
			<td>lebensfähiger Isolator für geschlüpfte/transferierte Eier4</td>
			<td c="">lebensfähige geschlüpfte/transferierte Eier weltweit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lauf 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gesamt</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Technische Ergebnisse der verschiedenen Schraffurexperimente. Die vorliegende Tabelle zeigt die Ergebnisse der 6 durchgeführten Serien keimfreier Schlupflöcher: Anzahl der gesammelten Eier, Lebensfähigkeit des Embryos nach 19 Tagen und lebensfähige geschlüpfte Küken in den verschiedenen Isolatoren.

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Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung keimfreier Küken aus Eiern einer kommerziellen Masthähnchenlinie, der Ross PM3. Diese Methode kann für die Erzeugung keimfreier Tiere aus anderen Geflügelarten angepasst werden.

Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K Aufrufe.  INRAE, PFIE, UE-1277. Hier beschreiben wir eine Methode zur Erzeugung keimfreier Küken aus Eiern einer kommerziellen Masthähnchenlinie, der Ross PM3. Diese Methode kann für die Erzeugung keimfreier Tiere aus anderen Geflügelarten angepasst werden.

Serie: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Aufzucht der Fruit Fly<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Entwicklungsbiologie

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial community assembly. This protocol outlines a system for studying microbial community dynamics in the phyllosphere of Napa cabbage plants. It describes how to grow germ-free plants in test tubes with a calcined clay and nutrient broth substrate. Inoculation of germ-free plants with specific microbial cultures provides opportunities to measure microbial growth and community dynamics in the phyllosphere. Through the use of sterile vegetable extract produced from cabbages shifts in microbial communities that occur during fermentation can also be assessed. This system is relatively simple and inexpensive to set up in the lab and can be used to address key ecological questions in microbial community assembly. It also provides opportunities to understand how phyllosphere community composition can impact the microbial diversity and quality of vegetable fermentations. This approach for developing gnotobiotic cabbage phyllosphere communities could be applied to other wild and agricultural plant species.

A method of growing germ-free Napa cabbages has been developed which enables researchers to evaluate how single microbial species or multispecies microbial communities interact on cabbage leaf surfaces. A sterile vegetable extract is also presented which can be used to measure shifts in community composition during vegetable fermentation.

Ein gnotobiotisches System zur Untersuchung der Mikrobiom-Montage in der Phyllosphäre und in der gemüseischen Fermentation

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Umwelt

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. Chicken embryos provide the opportunity to isolate preadipocytes from the earliest stage of adipose development. This primary cell can be used to identify factors influencing preadipocyte proliferation and adipogenic differentiation, making them a valuable model for studies related to childhood obesity and control of excess fat deposition in poultry. The rapid growth of postnatal adipose tissue effectively wastes feed by allocating it away from muscle growth in broiler chickens. Therefore, methods to understand the earliest stages of adipose tissue development may provide clues to regulate this tendency and identify ways to limit adipose expansion early in life. The present study was designed to develop an efficient method for isolation, primary culture, and adipogenic differentiation of preadipocytes isolated from developing adipose tissue of commercial broiler (meat-type) chick embryos. The procedure has been optimized to yield cells with high viability (~98%) and increased capacity to differentiate into mature adipocytes. This simple method of embryonic preadipocyte isolation, culture, and differentiation supports functional analyses of fat growth and development in early life.

The present protocol describes a simple method for isolating preadipocytes from adipose tissue in broiler embryos. This method enables isolation with high yield, primary culture, and adipogenic differentiation of preadipocytes. Oil Red O staining and lipid/DNA stain measured the adipogenic ability of isolated cells induced with differentiation media.

Isolierung von Präadipozyten aus Masthähnchen-Kieferembryonen

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Optimierung von GF Zebrafischmodellen: Erzeugung, Pflege und mikrobielle Studien

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autor im Rampenlicht: Etablierung keimfreier Zebrafische für Mikrobiota-Wirt-Beziehungsstudien

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of the specific role of individuals, defined or complex groups of microorganisms in host response. Traditionally bred and reared in flexible-film or semi-rigid isolators, germ-free mouse husbandry and experimental manipulation are costly and require numerous trained staff and a large space footprint in animal housing facilities. The IsoPositive caging system allows for experimental manipulation of germ-free mice in individual, hermetically-sealed, positive-pressure isolator cages (isocages), reducing cost and enabling greater flexibility in experimental manipulations. 
Here, a protocol is described for transferring germ-free mice from breeding isolators to isocages and subsequent fecal transfer from human donor stool into mice to create stable long-term gut "humanized" mice for future studies. The materials and preparation needed for the utilization of the isocage system are described, including the use of chlorine-dioxide sterilant chemical sterilant to clean cages, supplies, equipment, and personal protective equipment. The methods for confirming the germ-free status of transferred mice and how to determine contamination in the caging system are discussed. The procedure for husbandry, including bedding, food, and water supply, is further discussed. The protocol for human fecal slurry preparation and gavage into germ-free mice to create gut "humanized" mice, along with stool collection to monitor the microbial community composition of these mice, are described. An experiment illustrates that two weeks post-human fecal transplant allows for stable colonization of donor microbiota in the murine hosts, enabling subsequent experimental usage. Furthermore, the collection of humanized mouse feces in viability preservation media, enabling use in further functional experiments, is described. Overall, these methods allow for the safe and effective establishment of humanized mouse communities in experimental gnotobiotic cages for further manipulation.

This protocol describes the best practices for germ-free mouse transfer to and housing in experimental single-cage isolators (isocages) while maintaining sterile conditions. Methods for fecal transplant into germ-free mice and the collection of viable bacteria from these gut "humanized" mice for further applications are discussed.

Vorbereitung und Durchführung eines IsoPositiv-Käfig-Experiments zur Stuhltransplantation von Menschen in keimfreie Mäuse

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Etablierung und Pflege von Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Biologie

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain into an axenic insect is a powerful method to verify gut microbial function and elucidate the mechanisms underlying gut microbe-host interactions. Administering antibiotics or sterilizing egg surfaces are two commonly used methods to remove gut bacteria from insects. However, in addition to the potential adverse effects of antibiotics on insects, previous studies indicated that feeding antibiotics could not eliminate gut bacteria. Thus, germ-free artificial diets are generally employed to maintain axenic insects, which is a tedious and labor-intensive process that cannot fully resemble nutritional components in natural food. Described here is an efficient and simple protocol to prepare and maintain axenic larvae of a leaf beetle&#160;(Plagiodera versicolora). Specifically, surfaces of the beetle eggs were sterilized, following which germ-free poplar leaves were used to rear axenic larvae. The axenic status of the insects was further confirmed via culture-dependent and culture-independent assays. Collectively, by combining egg disinfection and germ-free cultivation, an efficient and convenient method was developed to obtain axenic P. versicolora, providing a readily transferable tool for other leaf-eating insects.

To obtain an axenic insect, its egg surface is sterilized, and the hatched larva is subsequently reared using axenic leaves. This method provides an efficient way for axenic insect preparation without administering antibiotics or developing an artificial diet, which can also be applied to other leaf-eating insects.

Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Herstellung keimfreier, schnell wachsender Masthähnchen aus einer kommerziellen Linie für Mikrobiota-Studien

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Protokoll für die Herstellung eines genetischen Kreuz der Nager Malaria-Erregern

Aufzucht der Fruit Fly

Ein gnotobiotisches System zur Untersuchung der Mikrobiom-Montage in der Phyllosphäre und in der gemüseischen Fermentation

Isolierung von Präadipozyten aus Masthähnchen-Kieferembryonen

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Vorbereitung und Durchführung eines IsoPositiv-Käfig-Experiments zur Stuhltransplantation von Menschen in keimfreie Mäuse

Etablierung und Pflege von Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Vorbereitung und Aufzucht axenischer Insekten mit gewebekultivierten Sämlingen für Wirt-Darm-Mikrobiota-Interaktionsstudien des Blattkäfers