Die Autoren danken Elliot Abattoir in Chesterfield für die Bereitstellung von Schweineaugen. Die Glasringe wurden nach unserem Design von dem Glasbläser Dan Jackson vom Department of Chemistry der University of Sheffield hergestellt. Die Autoren danken dem Medical Research Council (MR/S004688/1) für die Finanzierung. Die Autoren danken auch Frau Shanali Dikwella für die technische Hilfe bei der Hornhautzubereitung. Die Autoren danken Herrn Jonathan Emery für die Hilfe bei der Formatierung von Bildern.

Albino Laborkaninchen wurden im Labor für andere geplante experimentelle Arbeiten unter Home Office genehmigt Protokolle geopfert. Die Augen waren für den experimentellen Einsatz in diesen Studien nicht erforderlich, so dass sie für dieses Protokoll verwendet wurden.
1. Sterilisation
<ol><li>KRITISCHER SCHRITT: Alle Zangen und Scheren durch Einweichen für 1 h in 5% (v/v) Lösung von Distel in destilliertem Wasser, mit einer Bürste reinigen, mit Leitungswasser abspülen und im Ofen bei 185 °C für mindestens 2 h sterilisieren.</li>
	<li>Sterilisieren Sie alle anderen Glaswaren und Reagenzien durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 Minuten oder bereiten Sie Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Führen Sie die folgenden Verfahren in einem Sicherheitsschrank der Klasse II für Mikrobiologie durch.</li>
</ol>2. Probensammlung
<ol><li>Sammlung von Schweineaugen<ol>
<li>Große weiße Landrassesauen, ein Kreuz mit einem Hampshire-Schwein wurde verwendet. Die Tiere wurden mit einem elektrischen Strom betäubt und die Augen wurden 2 h später im Schlachthof enukleiert.</li>
		<li>KRITISCHER SCHRITT: Übertragen Sie die Augen nach der Enuklede in einer sterilen Phosphatgepufferten-Saline-Lösung (PBS), um zu verhindern, dass sie austrocknen, und verarbeiten Sie sie sofort nach ihrer Ankunft.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammlung von Kaninchenaugen<ol>
<li>Verbrauchen Sie die Hornhäuten und senden Sie in sterilem PBS ins Labor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung des korneoskleralen Knopfes
<ol><li>Verwenden Sie sterile Zangen, um das Gewebe um den Augapfel zu halten und es auf eine Petrischale zu übertragen. Entfernen Sie die Bindehaut und Muskelgewebe um den Augapfel auf einer Petrischale mit Skalpellklinge Nr. 15 und Zange.</li>
	<li>Heben Sie den Augapfel vorsichtig an, während Sie den Sehnerv mit Derzange halten und in ein 0,5 L Glas mit sterilem PBS übertragen.</li>
	<li>Sobald alle Augen von umgebendem Gewebe befreit sind, bewegen Sie sie mit sterilen Zangen in ein anderes 0,5 L Glas gefüllt mit 3% (v/v) Povidon Jod in PBS und lassen Sie für 1 min.</li>
	<li>Übertragen Sie Augäpfel auf ein anderes 0,5 L Glas mit sterilem PBS.</li>
	<li>Verwenden Sie Zangen, um das Auge noch auf einer Petrischale zu halten und machen Sie einen Schnitt in der Nähe der Hornhaut mit einem Skalpell Klinge Nr. 10A.</li>
	<li>KRITISCHER SCHRITT: Halten Sie die Kante des Schnitts und verwenden Sie eine Schere, um die Hornhaut zu verbrauchen, so dass ca. 3 mm Sklera um die Hornhaut herum liegen. Stellen Sie sicher, dass das scharfe Ende der Schere nicht die Iris oder das Aderhautgewebe durchbohrt und sich im supraaderoidalen Raum befindet.</li>
	<li>Halten Sie die korneosklerale Taste mit Zangen und verwenden Sie ein weiteres Paar spitzeRendzange, um das Uvealgewebe sanft zu trennen.</li>
	<li>Heben Sie den korneoskleralen Knopf von der verbleibenden Kugel und spülen Sie ihn kurz in 1,5% (v/v) Povidon-Jodlösung in PBS in einer 12-Well-Platte aus.</li>
	<li>Legen Sie den korneoskleralen Knopf in eine weitere 12 Wellplatte, die mit sterilem PBS gefüllt ist.</li>
	<li>Nach der Verarbeitung aller Augen(empfohlen maximal 40 Augen in einer Charge),legen Sie jeden korneoskleralen Knopf auf eine einzelne Petrischale (34 mm Durchmesser) Epithelseite nach oben und gießen Sie in 3 ml Kulturmedium vorgewärmt auf 37 °C. ANMERKUNG: Die Zusammensetzung des Kulturmediums ist wie folgt: Dulbeccos modifiziertes Eagle es Medium (DMEM): Schinken [1:1] ergänzt durch 5 'g'mL-1 Insulin und 10 ng'mL-1 epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), 10% (v/v) fetales Kalbsserum (FCS), 100 U'mL-1 Penicillin, 100 U-mL-1 Streptomycin und 2,5 g-mL -1 Amphotericin B. Optional kann das Medium mit 50 g l-1 Dextran ergänzt werden, um eine Schwellung der ausgeschnittenen Hornhaut während der weiteren Inkubationsschritte zu verhindern.</li>
	<li>Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator.</li>
</ol>4. Wartung der korneoskleralen Tasten
<ol><li>Verwenden Sie nach 24 Stunden die aseptische Technik, um Medien zu entfernen und durch 3 ml frische vorgewärmte Kulturmedien zu ersetzen, die Antibiotika enthalten. Halten Sie die korneoskleralen Knöpfe in den Medien mit Antibiotika für 48 h, um die Hornhäuten zu desinfizieren. Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator.</li>
	<li>KRITISCHER SCHRITT: Entfernen Sie nach 48 Stunden die Medien und spülen Sie Diehornhäuten mit 2 ml PBS ab. Dann halten Sie die korneoskleralen Knöpfe in antibiotikafreien Medien mindestens zwei oder idealerweise drei Tage vor einer experimentellen Infektion, um Restantibiotika aus dem Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Wechseln Sie die Medien innerhalb dieser drei Tage mindestens ein einziges Mal. Verwerfen Sie Hornhäuten, wenn sich Trübung im antibiotikafreien Medium entwickelt.</li>
</ol>5. Vorbereitung eines Inokulums
<ol><li>10 ml LB-Brühe in einen 50 ml Kegelkolben mit Schaumstoffstopfen gießen.</li>
	<li>Übertragen Sie eine Kolonie von P. aeruginosa Stamm PAO1 oder Stamm PA14 von einer frischen Agarplatte und inkubieren bei 37 °C für 3-4 h, bis die Bakterien in der Mitte-Log-Phase sind.</li>
	<li>Übertragen Sie die Bakterienkultur in ein 50 ml-Rohr und eine Zentrifuge bei 3.000 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet in PBS wieder auf.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 5.3 zwei weitere Male, um die Zellen zu waschen. Setzen Sie das Zellpellet in PBS wieder auf und passen Sie die optische Dichte bei 600 nm auf etwa 0,6 an, indem Sie steriles PBS als Rohling verwenden.</li>
</ol>6. Infizieren der korneoskleralen Taste
<ol><li>Entfernen Sie Die Medien von der Petrischale und spülen Sie Corneas zweimal mit 1 ml sterilem PBS aus.</li>
	<li>Drücken Sie vorsichtig die Zange, während Sie die Hornhaut dazwischen halten. Verwenden Sie ein 10A Skalpell, um vier Schnitte – zwei vertikale, zwei horizontale – im mittleren Abschnitt des korneoskleralen Knopfes durch die Epithelschicht zum darunter liegenden Stroma zu machen.</li>
	<li>Legen Sie eine sterile Glasform in eine 6-Well-Platte mit dem breiten Teil nach oben und legen Sie die Hornhaut in der Mitte der Glasform, Epithelseite nach unten. Machen Sie den Schnitt rechts in der Mitte des unteren Teils der Glasform.</li>
	<li>KRITISCHER SCHRITT: Gießen Sie 1 ml 1% (w/v) niedriger Schmelzpunkt Agar in DMEM gelöst, um die Glasform vollständig mit Hornhaut zu füllen.</li>
	<li>Lassen Sie den Agar setzen und dann die Glasform invertieren, so dass das Hornhautepithel nach oben zeigt.</li>
	<li>Pipette 15 l der Bakterienkultur mit OD600nm = 0,6 (für P. aeruginosa entspricht dies etwa 1 x 107 Koloniebildenden Einheiten (CFU) in 15 l) direkt in einen Schnittbereich und dann 85 l PBS nach oben geben, um das Hornhautepithel feucht zu halten. Verdünnen Sie die verbleibende Bakterienkultur und Platte auf Agar, um koloniebildende Einheiten für das Inokulum zu zählen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml DMEM ohne Antibiotika auf den Boden jedes Brunnens mit der Glasform. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte mit den infizierten korneoskleralen Knöpfen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 für bis zu 24 h.</li>
	<li>Richten Sie bei jedem Experiment nicht infizierte Kontrollhornhaut ein. Um die nicht infizierte Kontrolle einzurichten, ersetzen Sie die 15 L der Bakterienkultur in Schritt 6.6 durch sterile PBS.</li>
</ol>7. Homogenisierung der Hornhaut zur Ernte der Bakterien
<ol><li>Entsorgen Sie das DMEM-Medium von der Unterseite der 6-Well-Platte und fügen Sie 1 ml sterile PBS hinzu, um den Boden des Brunnens zu spülen.</li>
	<li>Entfernen Sie PBS vorsichtig durch Pipettieren, ohne den zentralen Teil der korneoskleralen Taste zu berühren. Entfernen Sie den Glasring mit sterilen Zangen und legen Sie ihn in das 5% Distel.</li>
	<li>Spülen Sie die Oberseite der korneoskleralen Taste mit 1 ml PBS zweimal [optional] vorsichtig ab.</li>
	<li>Halten Sie die Kante des korneoskleralen Knopfes mit feinen Spitzenzangen und lösen Sie sie vom Darunterliegenden Agar.</li>
	<li>Übertragen Sie die Hornhaut auf ein 50 ml Rohr gefüllt mit eiskalten 1-2 ml PBS.</li>
	<li>Verwenden Sie einen feinen Spitzenhomogenisator, um die Oberseite der infizierten Hornhaut zu schieren. Das Gewebe muss nicht vollständig liquidiert werden. Der Homogenisator hilft, Bakterien vom Hornhautepithel und dem Schnittbereich zu lösen.</li>
	<li>Wirbeln Sie die Hornhaut in PBS für ein paar Sekunden, um den Inhalt zu mischen.</li>
	<li>Fügen Sie 20 l des Homogenats auf 180 l PBS hinzu und führen Sie serielle Verdünnungen in einer 96-Well-Platte durch.</li>
	<li>Die Suspension wird seriell auf 10-4 und 10-5 Verdünnung und Pipette 10 l des verdünnten Homogenats mit Bakterien auf eine Blutagarplatte verdünnt. Inkubieren Sie die Platte für 8 Stunden und zählen Sie die Anzahl der KBE. Bei der Prüfung der Wirkung antimikrobieller Mittel muss der entsprechende Verdünnungsfaktor experimentell gefunden werden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-Resistant+Pseudomonas+aeruginosa+Keratitis+Risk+Factors,+Clinical+Characteristics,+and+Outcomes.">Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes.</a> Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).</li><li>Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratitis.">Keratitis.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm:+Potential+therapeutic+targets.">Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets.</a> Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).</li><li>Ersoy, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+a+Fundamental+Flaw+in+the+Paradigm+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing.">Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing.</a> EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).</li><li>Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-dependent+Induction+of+Transient+Antibiotic+Resistance:+A+Prelude+to+Treatment+Failure.">Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure.</a> EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).</li><li>Pinnock, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+rabbit+and+human+corneas+as+models+for+bacterial+and+fungal+keratitis.">Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).</li><li>Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+Air-Liquid+Canine+Corneal+Organ+Culture+Model+To+Study+Acute+Herpes+Keratitis.">Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis.</a> Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).</li><li>Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Caprine+Model+to+Study+Virulence+Factors+in+Keratitis.">Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis.</a> Journal of Ophthalmic &amp; Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).</li><li>Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transmission+from+contact+lenses+to+porcine+corneas:+An+ex+vivo+study.">Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li><li>Brothers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Impediment+of+Corneal+Cell+Migration.">Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (7), (2015).</li><li>Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Organotypic+Corneal+Model+of+Acute+Epithelial+Herpes+Simplex+Virus+Type+I+Infection.">Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li><li>Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-Defense+Mechanism+of+the+Ocular+Surfaces.">Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+porcine+corneal+endothelial+organ+culture+model+for+research+purposes.">Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Oh, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+Porcine+Cornea+for+Biomedical+Applications.">Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).</li><li>Shi, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protectively+Decellularized+Porcine+Cornea+versus+Human+Donor+Cornea+for+Lamellar+Transplantation.">Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation.</a> Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).</li><li>Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+porcine+eyeball+as+an+in-vitro+model+for+dry+eye.">Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).</li><li>Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Corneal+Organ+Culture+Model+for+Wound+Healing+Studies.">Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der Haupttreiber für die Entwicklung dieses Keratitismodells unter Verwendung von Ex-vivo-Schweinehornhaut besteht darin, Forschern, die neuartige antimikrobielle Mittel entwickeln, ein repräsentatives In-vitro-Modell zur genaueren Bestimmung der antimikrobiellen Wirksamkeit in den präklinischen Stadien zur Verfügung zu stellen. Dies wird Forschern, die an der Entwicklung neuer antimikrobiellen Mittel beteiligt sind, eine bessere Kontrolle über das Arzneimitteldesign und die Rezeptur in den präklinischen Stadien bi...

Hornhautinfektionen sind wichtige Ursachen für Erblindung und treten in epidemischen Ausmaßen in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen auf. Die Ätiologie der Krankheit variiert von Region zu Region, aber Bakterien machen die steile Mehrheit dieser Fälle aus. Pseudomonas aeruginosa ist ein wichtiger Erreger, der eine schnell fortschreitende Krankheit verursacht. In vielen Fällen, Patienten mit stromalen Narben, unregelmäßigen Astigmatismus links, erfordern Transplantation oder im schlimmsten Fall, verlieren ein Auge1,2.
Bakterielle Keratitis verursacht durch P. aeruginosa ist eine schwierige Augeninfektion zu behandeln, vor allem aufgrund der zunehmenden Entstehung von antimikrobiellen resistenten Stämmen von P. aeruginosa. Innerhalb des letzten Jahrzehnts hat sich gezeigt, dass das Testen und Entwickeln neuer Behandlungen für Hornhautinfektionen im Allgemeinen und solche, die durch Pseudomonas sp. verursacht werden, im Besonderen unerlässlich ist, um den aktuellen Trend der Antibiotikaresistenz zu bekämpfen3.
Für die Prüfung der Wirksamkeit neuer Behandlungen von Hornhautinfektionen sind konventionelle mikrobiologische In-vitro-Methoden aufgrund des Unterschieds in der bakteriellen Physiologie während der Laborkultur und bei Infektionen in vivo sowie aufgrund des Fehlens der Wirtsschnittstelle4,5ein schlechtes Ersatzzeichen. In-vivo-Tiermodelle sind jedoch teuer, zeitaufwändig, können nur eine kleine Anzahl von Repliken liefern und Bedenken hinsichtlich des Tierschutzes aufkommen lassen.
In diesem Artikel zeigen wir ein einfaches und reproduzierbares organotypisches Ex-vivo-Schweinemodell der Keratitis, das verwendet werden kann, um verschiedene Behandlungen auf akute und chronische Infektionen zu testen. Wir haben P. aeruginosa für dieses Experiment verwendet, aber das Modell funktioniert auch gut mit anderen Bakterien und Organismen wie Pilzen und Hefe, die Keratitis verursachen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31425-100mg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12899357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + glutamax</td>
			<td>SLS</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td>Homogeniser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not appplicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12664785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35x10mm CytoOne</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Weldricks pharmacy</td>
			<td>2122828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis

Bei der Entwicklung neuartiger antimikrobieller Wirkstoffe hängt der Erfolg von Tierversuchen von einer genauen Extrapolation der antimikrobiellen Wirksamkeit von In-vitro-Tests bis hin zu Tierinfektionen in vivo ab. Die bestehenden In-vitro-Tests überschätzen in der Regel die antimikrobielle Wirksamkeit, da das Vorhandensein von Wirtsgewebe als Diffusionsbarriere nicht berücksichtigt wird. Um diesen Engpass zu überwinden, haben wir ein ex vivo Porcine Corneal Modell der bakteriellen Keratitis unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa als prototypischem Organismus entwickelt. Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung der Schweinehornhaut und Protokoll für die Einrichtung der Infektion. Maßgeschneiderte Glasformen ermöglichen eine einfache Einrichtung der Hornhaut für Infektionsstudien. Das Modell imitiert in vivo-Infektion, da die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Bakteriums abhängt, Hornhautgewebe zu schädigen. Die Etablierung einer Infektion wird als eine Zunahme der Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten überprüft, die über lebensfähige Plattenzählungen bewertet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Infektion in den ex vivo Hornhäuten mit der hier beschriebenen Methode sehr reproduzierbar nachgewiesen werden kann. Das Modell kann in Zukunft erweitert werden, um Keratitis zu imitieren, die durch andere Mikroorganismen als P. aeruginosaverursacht wird. Das Endziel des Modells besteht darin, die Wirkung der antimikrobiellen Chemotherapie auf den Fortschritt einer bakteriellen Infektion in einem Szenario zu untersuchen, das repräsentativer für In-vivo-Infektionen ist. Auf diese Weise wird das hier beschriebene Modell den Einsatz von Tieren zu Testzwecken reduzieren, die Erfolgsraten in klinischen Studien verbessern und letztlich eine schnelle Übersetzung neuartiger antimikrobiellen Mittel in die Klinik ermöglichen.

Das Design der Glasformen ist eine innovative und originelle Idee, deren Verwendung es uns ermöglichte, das Modell in konsistenter Weise mit minimalen/keinen Problemen mit Verunreinigungen einzurichten. Die Formen wurden von einem Glasgebläse an der University of Sheffield auf der Grundlage eines Entwurfs(Abbildung 1A) hergestellt. Das Versuchsaufbau behält die konvexe Form der Hornhaut bei und hält Bakterien auf der Oberseite des Epithels, wo die Infektion stattfindet (<strong class="xf...

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Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Einrichtung eines Ex-vivo-Schweinemodells der bakteriellen Keratitis. Pseudomonas aeruginosa wird als prototypischer Organismus verwendet. Dieses innovative Modell imitiert in vivo-Infektionen, da die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Bakteriums abhängt, Hornhautgewebe zu schädigen.

Etablierung eines Porcine Ex Vivo Cornea Modells zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen gegen bakterielle Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

establishing-porcine-ex-vivo-cornea-model-for-studying-drug

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.1K Aufrufe.  University of Sheffield. Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Einrichtung eines Ex-vivo-Schweinemodells der bakteriellen Keratitis. Pseudomonas aeruginosa wird als prototypischer Organismus verwendet. Dieses innovative Modell imitiert in vivo-Infektionen, da die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Bakteriums abhängt, Hornhautgewebe zu schädigen.

Serie: Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Wiederkehrende Herpetic Stromakeratitis in Mäuse, ein Modell für das Studium der menschlichen HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Mehrskalenanalyse des Bakterienwachstums unter Stressbehandlungen

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.