著者らは、チェスターフィールドのエリオット・アバトワールが豚の目を提供してくれたことに感謝したいと考えています。ガラスリングは、シェフィールド大学化学科のガラスブロワーダンジャクソンによって私たちのデザインに基づいて作られました。著者らは、医学研究評議会(MR/S004688/1)の資金調達に感謝したいと考えています。著者らはまた、角膜の準備に関する技術的な助けをしてくれたシャナリ・ディクウェラ夫人に感謝したいと考えています。著者たちは、写真の書式設定に協力してくれたジョナサン・エメリー氏に感謝したいと考えています。

アルビノの実験室ウサギは、ホームオフィス承認のプロトコルの下で他の計画された実験作業のために実験室で犠牲にされました。これらの研究では、目は実験用に必要とされなかったため、このプロトコルに使用されました。
1. 殺菌
<ol><li>クリティカルステップ:蒸留水にディステルの5%(v/v)溶液に1時間浸漬し、ブラシで洗浄し、水道水で洗い流し、最低2時間185°Cのオーブンで殺菌することによって、すべての鉗子とはさみを消毒します。</li>
	<li>121°Cで15分間オートクレーブ処理を行い、他のすべてのガラス製品や試薬を殺菌するか、メーカーの指示に従って試薬を準備します。クラスII微生物安全キャビネットで以下の手順を実行します。</li>
</ol>2. サンプルコレクション
<ol><li>ブタの目のコレクション<ol>
<li>大きな白い競主が雌し、ハンプシャーイノシシとの十字架が使用されました。動物は電流で驚き、目はアバトワールで2時間後に核を摘出した。</li>
		<li>クリティカルステップ:一度核を取り除き、滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で目をラボに移し、乾燥を防ぎ、到着時にすぐに処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ウサギの目のコレクション<ol>
<li>角膜を切除し、滅菌PBSでラボに送ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 角膜ボタンの準備
<ol><li>滅菌鉗子を使用して眼球を取り囲む組織を保持し、ペトリ皿に移します。メスの刃15番と鉗子を使ってペトリ皿の眼球の周りの結膜と筋組織を取り除きます。</li>
	<li>鉗子で視神経を保持しながら眼球を静かに持ち上げ、滅菌PBSで満たされた0.5 L瓶に移します。</li>
	<li>すべての目が周囲の組織から取り除かれたら、PBSで3%(v/v)ポビドネヨウ素で満たされた別の0.5 L瓶に無菌鉗子を使用してそれらを移動し、1分間放置します。</li>
	<li>無菌PBSで別の0.5 L瓶に眼球を移す。</li>
	<li>ペトリ皿に目を保持し、メスの刃なし10Aで角膜の近くでカットを行うために鉗子を使用してください。</li>
	<li>クリティカルステップ:カットの端を保持し、角膜を囲むスクレアの約3ミリメートルを残して角膜を切除するためにはさみを使用しています。はさみの鋭い端が虹彩や脈絡膜組織を突き刺さないことを確認し、上脈絡膜空間にあります。</li>
	<li>角膜ボタンを鉗子で押し、尖ったエンド鉗子の別のペアを使用して、尿組織を穏やかに分離します。</li>
	<li>残りの地球から角膜ボタンを持ち上げ、PBSの1.5%(v/v)ポビドンヨウ素溶液を12ウェルプレートで短時間すすいだ。</li>
	<li>角膜ボタンを滅菌PBSで満たされた別の12ウェルプレートに入れてください。</li>
	<li>すべての目(推奨最大40の目を1バッチで)処理した後、各角膜切開ボタンを個々のペトリ皿(直径34mm)上皮側に上に置き、3mLの培養培地を37°Cに予熱して注ぎます。 注:培養培地の組成は次のとおりです:Dulbeccoの修飾イーグルの媒体(DMEM):ハムの[1:1]5μg∙mL-1インスリンと10ng∙mL-1表皮成長因子(EGF)、10%(v/v)胎児血清(FCS)、100 U∙mL -1陰茎、100 U∙mL-1ペニシル 100 U∙mL-1ストレプトマイシンおよび2.5 μg∙mL-1アンホテリシンB.任意工程として、培地は、さらにインキュベーションステップ中に切除角膜の膨潤を防ぐために50g∙L-1デキストランで補うことができる。</li>
	<li>加湿組織培養インキュベーターで37°Cでインキュベートする。</li>
</ol>4. 角膜ボタンのメンテナンス
<ol><li>24時間後、無菌技術を使用して培地を除去し、抗生物質を含む新鮮な前温め培養培地の3mLに置き換えます。角膜を消毒するために48時間抗生物質でメディアの角結膜ボタンを維持します。加湿組織培養インキュベーターで37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>クリティカルステップ:48時間後、培地を取り出し、2mLのPBSで角膜をすすいます。次に、抗生物質を含まない培地に角膜ボタンを少なくとも2日または理想的には実験感染前に保管し、組織から残留抗生物質を除去する。</li>
	<li>加湿組織培養インキュベーターで37°Cでインキュベートする。この 3 日以内にメディアを少なくとも 1 回変更してください。抗生物質を含まない培地で濁りが生じた場合は、角膜を捨てる。</li>
</ol>5. 接種の準備
<ol><li>泡ストッパーと50 mL円錐形フラスコにLBスープの10 mLを注ぎます。</li>
	<li>P.緑素吸い株PAO1または株PA14のコロニーを新鮮な寒天プレートから移し、細菌が中ログ段階になるまで3〜4時間37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>細菌の培養物を50mLチューブ、遠心分離機を3,000 x g で5分間移動します。上清を取り除き、PBSで細胞ペレットを再び懸濁します。</li>
	<li>ステップ 5.3 をさらに 2 回繰り返して、細胞を洗浄します。PBSで細胞ペレットを再懸濁し、無菌PBSをブランクとして使用して600nmから約0.6の光学密度を調整します。</li>
</ol>6. 角膜ボタンに感染する
<ol><li>ペトリ皿から培地を取り出し、1 mLの無菌PBSで角膜を2回洗いすります。</li>
	<li>角膜を中間に持ちながら、鉗子を軽く絞ります。10Aメスを使用して、上皮層から下層の間質まで角膜ボタンの中央部に4つのカット(2つの垂直、2つの水平)を作ります。</li>
	<li>広い部分を上にして6ウェルプレートに無菌ガラス型を入れ、角膜をガラス型の真ん中に置き、上皮側を下に向けます。ガラス金型の底部の中央にカットを右にします。</li>
	<li>臨界ステップ:DMEMに溶解した低融点寒天1%(w/v)の1mLを注ぎ、ガラスモールドを角膜で完全に満たします。</li>
	<li>角膜上皮が上向きになるように、寒天をセットし、ガラスの型を反転させます。</li>
	<li>OD600nm = 0.6の細菌培養のピペット15 μL(P. 緑素吸皮 症では、これは15μLの約1 x 107 コロニー形成ユニット(CFU)に直接相当し、85μLのPBSを上部に加えて角膜上皮を湿潤させます。残りの細菌培養物とプレートを寒天で希釈し、接種物のコロニー形成単位を数えます。</li>
	<li>ガラスモールドで各井戸の底に抗生物質なしでDMEMの1 mLを追加します。37°Cの加湿インキュベーターで感染した角膜ボタンで6ウェルプレートをインキュベートし、最大24時間5%CO2を使用します。</li>
	<li>すべての実験と一緒に未感染のコントロール角膜を設定します。感染していないコントロールを設定するには、ステップ6.6の細菌培養の15 μLを滅菌PBSに置き換えます。</li>
</ol>7. 細菌を収穫する角膜の均質化
<ol><li>6ウェルプレートの底からDMEM培地を捨て、1mLの滅菌PBSを加えて井戸の底をすすいだ。</li>
	<li>角膜ボタンの中央部に触れずにピペット処理を行い、PBSを穏やかに除去します。滅菌鉗子を使用してガラスリングを取り外し、5%のディステルに入れます。</li>
	<li>PBS 1 mL を 2 回使用して角膜ボタンの上部を 2 回やさしくすすります。</li>
	<li>角膜ボタンの端を細かい先端鉗子で押さえ、下の寒天から取り外します。</li>
	<li>氷冷1-2mLのPBSで満たされた50 mLチューブに角膜を移します。</li>
	<li>感染した角膜の上部を薄くするために細かい先端ホモジナイザーを使用してください。組織を完全に清算する必要はありません。ホモジナイザーは、角膜上皮および切り傷領域から細菌を取り外すのに役立ちます。</li>
	<li>内容物を混ぜるためにPBSで角膜を数秒間渦を入れる。</li>
	<li>20 μL のホモジネートを PBS の 180 μL に加え、96 ウェルプレートでシリアル希釈を行います。</li>
	<li>懸濁液を10-4 と10-5 希釈に連続して希釈し、細菌を用いたホモゲネートのピペット10μLを血液寒天板に上に入れる。プレートを8時間インキュベートし、CFUの数を数えます。抗菌薬の効果をテストする場合、適切な希釈因子を実験的に到着する必要があります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-Resistant+Pseudomonas+aeruginosa+Keratitis+Risk+Factors,+Clinical+Characteristics,+and+Outcomes.">Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes.</a> Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).</li><li>Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratitis.">Keratitis.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm:+Potential+therapeutic+targets.">Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets.</a> Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).</li><li>Ersoy, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+a+Fundamental+Flaw+in+the+Paradigm+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing.">Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing.</a> EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).</li><li>Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-dependent+Induction+of+Transient+Antibiotic+Resistance:+A+Prelude+to+Treatment+Failure.">Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure.</a> EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).</li><li>Pinnock, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+rabbit+and+human+corneas+as+models+for+bacterial+and+fungal+keratitis.">Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).</li><li>Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+Air-Liquid+Canine+Corneal+Organ+Culture+Model+To+Study+Acute+Herpes+Keratitis.">Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis.</a> Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).</li><li>Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Caprine+Model+to+Study+Virulence+Factors+in+Keratitis.">Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis.</a> Journal of Ophthalmic &amp; Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).</li><li>Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transmission+from+contact+lenses+to+porcine+corneas:+An+ex+vivo+study.">Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li><li>Brothers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Impediment+of+Corneal+Cell+Migration.">Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (7), (2015).</li><li>Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Organotypic+Corneal+Model+of+Acute+Epithelial+Herpes+Simplex+Virus+Type+I+Infection.">Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li><li>Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-Defense+Mechanism+of+the+Ocular+Surfaces.">Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+porcine+corneal+endothelial+organ+culture+model+for+research+purposes.">Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Oh, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+Porcine+Cornea+for+Biomedical+Applications.">Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).</li><li>Shi, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protectively+Decellularized+Porcine+Cornea+versus+Human+Donor+Cornea+for+Lamellar+Transplantation.">Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation.</a> Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).</li><li>Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+porcine+eyeball+as+an+in-vitro+model+for+dry+eye.">Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).</li><li>Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Corneal+Organ+Culture+Model+for+Wound+Healing+Studies.">Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

このケラティスモデルの開発の主な要因は、前臨床段階で抗菌効果をより正確に決定するために、代表的なin vitroモデルを新しい抗菌剤を開発する研究者に提供することです。これは、新しい抗菌薬の開発に関与する研究者に、前臨床段階での薬物設計と製剤をより詳細に制御し、臨床試験での成功を高め、標的研究を可能にすることによって動物の使用を減らし、新しい抗菌薬を診療所に?...

角膜感染症は失明の重要な原因であり、低所得国と中所得国の流行割合で発生します。この疾患の病因は地域によって異なるが、細菌はこれらの症例の大部分を占める。緑膿菌は、急速に進行する疾患を引き起こす重要な病原体である。多くの場合、患者は、間質瘢痕、不規則な乱視、移植を必要とする、または最悪のシナリオでは、目1、2を失う。
P.緑素症によって引き起こされる細菌性角膜炎は、特にP.緑素症の抗菌耐性株の出現の増加に起因する治療が困難な眼感染症である。過去10年の間に、角膜感染症の新しい治療法の試験と開発、一般的に、特にシュードモナスspによって引き起こされるものは、抗生物質耐性3の現在の傾向に対抗するために不可欠であることが明らかになった。
角膜感染症に対する新しい治療法の有効性を試験するために、従来のインビトロ微生物学的方法は、実験室培養中および生体内感染中の細菌生理学の差と、宿主界面4,5の欠如による貧弱な代理である。しかし、生体内動物モデルは高価で時間がかかり、少数の複製を提供し、動物の福祉に関する懸念を提起することができます。
本稿では、急性および慢性感染症に対する様々な治療法の試験に使用できる角膜炎の、簡単で再現可能なorganotypic ex vivoブタモデルを示す。今回の実験では P.緑素吸い分を 用いていますが、他の細菌や角膜炎を引き起こす真菌や酵母などの生物ともうまく機能します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31425-100mg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12899357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + glutamax</td>
			<td>SLS</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td>Homogeniser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not appplicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12664785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35x10mm CytoOne</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Weldricks pharmacy</td>
			<td>2122828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis

新しい抗菌剤を開発する場合、動物試験の成功は、生体内検査から生体内の動物感染までの抗菌効果の正確な外挿に依存する。既存のin vitro試験は、典型的には拡散障壁としての宿主組織の存在が考慮されないとして抗菌効果を過大評価する。このボトルネックを克服するために、緑膿菌を原型生物として使用した細菌性角膜炎 の エキビボブタコネ角膜モデルを開発しました。この資料では、ブタの角膜の調製と感染の確立のためのプロトコルについて説明します。別注ガラス型は、感染研究のための角膜の簡単なセットアップを可能にする。このモデルは、細菌の増殖が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するので、生体内感染を模倣する。感染の確立は、生存可能なプレート数を介して評価されるコロニー形成ユニットの数の増加として検証される。この結果は、ここで説明する方法を用いて、ex vivo角膜において非常に再現性の高い方法で感染を確立できることを示している。このモデルは、 将来的にP.緑素症以外の微生物によって引き起こされる角膜炎を模倣するために拡張することができます。このモデルの究極の目的は、生体内感染をより代表的なシナリオで抗菌化学療法が細菌感染の進行に及ぼす影響を調査することである。そうすることで、ここで説明するモデルは、検査のための動物の使用を減らし、臨床試験での成功率を向上させ、最終的には新しい抗菌薬をクリニックに迅速に翻訳することを可能にする。

ガラスの金型の設計は革新的で独創的なアイデアであり、その使用により、汚染に関する問題を最小限に抑えて一貫した方法でモデルを設定することができました。金型は、設計に基づいてシェフィールド大学のガラスブロワーによって製造されました(図1A)。実験のセットアップは角膜の凸形状を維持し、感染が起こる上皮の上に細菌を保持する(図1B)?...

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Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

この記事では、細菌性角膜炎のex vivo ブタモデルを設定するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。 緑膿菌 は原型生物として用いられる。細菌増殖は、細菌が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するように、この革新的なモデルは、生体内感染を模倣する。

細菌性角膜炎に対する薬物治療を研究するためのブタEx Vivoコルネアモデルの確立

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

establishing-porcine-ex-vivo-cornea-model-for-studying-drug

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.1K ビュー.  University of Sheffield. この記事では、細菌性角膜炎のex vivo ブタモデルを設定するためのステップバイステップのプロトコルについて説明します。 緑膿菌 は原型生物として用いられる。細菌増殖は、細菌が角膜組織を損傷する細菌の能力に依存するように、この革新的なモデルは、生体内感染を模倣する。

ビデオ: Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

マウスにおける再発性ヘルペス性間質性角膜炎、人間のHSKを研究するためのモデル

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

免疫・感染学

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

生物発光細菌のイメージング<emインビボで&gt;</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

タングウイルスに対する新規抗ウイルス剤の同定のためのアッセイ

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

アン<em&gt;エクスビボ</em急性脳スライスにおけるオリゴデンドロサイト指向T細胞攻撃の&gt;モデル

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

マクロファージ継代に対する薬効を評価するために、ハイスループットアッセイの互換性<em&gt;結核菌</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

病原性細菌に対する免疫学的応答を評価するための Opsonophagocytic 殺害アッセイ

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

ストレス治療下での細菌増殖の多スケール分析

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.