Gli autori ringraziano Elliot Abattoir a Chesterfield per aver fornito occhi suini. Gli anelli di vetro sono stati realizzati sulla base del nostro design dal soffiatore di vetro Dan Jackson del Dipartimento di Chimica dell'Università di Sheffield. Gli autori ringraziano il Medical Research Council (MR/S004688/1) per il finanziamento. Gli autori ringraziano anche la signora Shanali Dikwella per l'aiuto tecnico nella preparazione della cornea. Gli autori ringraziano l'onorevole Jonathan Emery per l'aiuto nella formattazione delle immagini.

I conigli da laboratorio albini sono stati sacrificati in laboratorio per altri lavori sperimentali pianificati secondo protocolli approvati dall'ufficio domestico. Gli occhi non erano necessari per l'uso sperimentale in quegli studi, quindi sono stati utilizzati per questo protocollo.
1. Sterilizzazione
<ol><li>FASE CRITICA: Disinfettare tutte le forcep e le forbici immergendo per 1 h in soluzione 5% (v/v) di Distel in acqua distillata, pulire con una spazzola, risciacquare con acqua del rubinetto e sterilizzare in forno a 185 °C per un minimo di 2 ore.</li>
	<li>Sterilizzare tutte le altre vetrerie e reagenti in autoclave a 121 °C per 15 minuti o preparare reagenti secondo le istruzioni del produttore. Eseguire le seguenti procedure in un armadio di sicurezza microbiologica di classe II.</li>
</ol>2. Raccolta dei campioni
<ol><li>Collezione di occhi suini<ol>
<li>Grandi scrofe landrace bianche, fu usata una croce con un cinghiale dell'Hampshire. Gli animali sono rimasti sbalorditi da una corrente elettrica e gli occhi sono stati enucleati 2 ore dopo nel mattatoio.</li>
		<li>FASE CRITICA: Una volta enucleata, trasferire gli occhi in laboratorio in una soluzione salina tamponata di fosfato sterile (PBS) per evitare che si asciughino e li elaborino immediatamente all'arrivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collezione di occhi di coniglio<ol>
<li>Asportare le cornee e inviarle al laboratorio in PBS sterile.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparazione del pulsante corneosclerale
<ol><li>Utilizzare forcelle sterili per tenere il tessuto che circonda il bulbo oculare e trasferirlo in una piastra di Petri. Rimuovere la congiuntiva e il tessuto muscolare attorno al bulbo oculare su una piastra di Petri usando la lama bisturi n. 15 e le fasci.</li>
	<li>Sollevare delicatamente il bulbo oculare tenendo il nervo ottico con le forcep e trasferirlo in un barattolo da 0,5 L riempito con PBS sterile.</li>
	<li>Una volta che tutti gli occhi sono stati liberati dal tessuto circostante, spostarli usando forcelle sterili in un altro barattolo da 0,5 L riempito con iodio povidone 3% (v / v) in PBS e lasciare per 1 minuto.</li>
	<li>Trasferire i bulbi oculari in un altro barattolo da 0,5 L con PBS sterile.</li>
	<li>Utilizzare le forcep per tenere fermo l'occhio su una piastra di Petri e fare un taglio vicino alla cornea con una lama bisturi n. 10A.</li>
	<li>FASE CRITICA: Tenere il bordo del taglio e utilizzare le forbici per asportare la cornea lasciando circa 3 mm di sclera che circondano la cornea. Assicurarsi che l'estremità affilata delle forbici non perfori l'iride o il tessuto coroiroidale e si trova nello spazio sopracoroidale.</li>
	<li>Tenere il pulsante corneosclerale con le forcelle e utilizzare un altro paio di forcelle appuntite per separare delicatamente il tessuto uveale.</li>
	<li>Sollevare il pulsante corneosclerale dal globo rimanente e sciacquarlo brevemente in una soluzione di iodio povidone 1,5% (v/v) in PBS in una piastra da 12 po po.</li>
	<li>Posizionare il pulsante corneosclerale in un'altra piastra di 12 pozzi piena di PBS sterile.</li>
	<li>Dopo aver elaborato tutti gli occhi(consigliato massimo 40 occhi in un lotto),posizionare ogni pulsante corneosclerale su una singola piastra di Petri (34 mm di diametro) lato epiteliale verso l'alto e versare 3 mL di mezzo di coltura pre-riscaldato a 37 °C. NOTA: La composizione del mezzo di coltura è la seguente: mezzo dell'aquila modificato (DMEM) di Dulbecco: prosciutto [1:1] integrato con insulina 5 μg-mL-1 e 10 ng-mL-1 fattore di crescita epidermico (EGF), 10% (v/v) siero fetale del vitello (FCS), 100 U-mL-1 penicillina, 100 U-mL-1 streptomicina e 2,5 μg-mL-1 ampotericina B. Come passaggio opzionale, il mezzo può essere integrato con 50 g-L-1 dextran per prevenire il gonfiore della cornea accisa durante le ulteriori fasi di incubazione.</li>
	<li>Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato.</li>
</ol>4. Mantenimento dei bottoni corneosclerali
<ol><li>Dopo 24 ore, utilizzare la tecnica aseptica per rimuovere i mezzi e sostituire con 3 mL di mezzi di coltura freschi pre-riscaldati contenenti antibiotici. Tenere i bottoni corneosclerali nei mezzi con antibiotici per 48 ore per disinfettare le cornee. Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato.</li>
	<li>FASE CRITICA: Dopo 48 ore, rimuovere il supporto e risciacquare le cornee con 2 mL di PBS. Quindi tenere i pulsanti corneosclerali in mezzi senza antibiotici per un minimo di due o idealmente tre giorni prima dell'infezione sperimentale, per rimuovere gli antibiotici residui dal tessuto.</li>
	<li>Incubare a 37 °C in un incubatore di coltura tissutale umidificato. Cambia i media almeno un'altra volta entro questi tre giorni. Scartare le cornee se si sviluppa una torbidità nel mezzo privo di antibiotici.</li>
</ol>5. Preparazione di un inoculo
<ol><li>Versare 10 ml di brodo LB in un pallone conico da 50 ml con un tappo di schiuma.</li>
	<li>Trasferire una colonia di ceppo P. aeruginosa PAO1 o ceppo PA14 da una piastra di agar fresca e incubare a 37 °C per 3-4 ore fino a quando i batteri sono in fase di registro intermedio.</li>
	<li>Trasferire la coltura di batteri in un tubo da 50 ml e centrifugare a 3.000 x g per 5 min. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet di cella in PBS.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 5.3 altre due volte per lavare le cellule. Sospendere di nuovo il pellet di cellule in PBS e regolare la densità ottica a 600 nm a circa 0,6 utilizzando PBS sterile come vuoto.</li>
</ol>6. Infettare il pulsante corneosclerale
<ol><li>Rimuovere i supporti dalla piastra di Petri e risciacquare le cornee due volte con 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Spremere delicatamente le forcep tenendo la cornea in mezzo. Utilizzare un bisturi 10A per effettuare quattro tagli - due verticali, due orizzontali - nella sezione centrale del pulsante corneosclerale attraverso lo strato epiteliale fino allo stroma sottostante.</li>
	<li>Posizionare uno stampo di vetro sterile in una piastra di 6 po 'con la parte larga verso l'alto e posizionare la cornea al centro dello stampo di vetro, lato epitelio rivolto verso il basso. Fare il taglio proprio al centro della parte inferiore dello stampo di vetro.</li>
	<li>FASE CRITICA: Versare 1 mL di 1% (con v) agar a basso punto di fusione sciolto in DMEM per riempire completamente lo stampo di vetro con cornea.</li>
	<li>Lasciare impostare l'agar e quindi invertire lo stampo di vetro in modo che l'epitelio corneale sia rivolto verso l'alto.</li>
	<li>Pipetta 15 μL della coltura batterica con OD600nm = 0,6 (per P. aeruginosa questo equivale a circa 1 x 107 unità di formazione di colonie (CFU) in 15 μL) direttamente in una zona tagliata e quindi aggiungere 85 μL di PBS alla parte superiore per mantenere umido l'epitelio corneale. Diluire la rimanente coltura batterica e la piastra sull'agar per contare le unità di formazione della colonia per l'inoculo.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di DMEM senza antibiotici sul fondo di ogni pozzo con lo stampo in vetro. Incubare la piastra a 6 po 'con i bottoni corneosclerali infetti in un incubatore umidificato a 37 °C con 5% di CO2 per un massimo di 24 ore.</li>
	<li>Imposta cornea di controllo non infetta insieme ad ogni esperimento. Per impostare il controllo non infetto, sostituire i 15 μL di coltura batterica nella fase 6.6 con PBS sterile.</li>
</ol>7. Omogeneizzazione della cornea per raccogliere i batteri
<ol><li>Scartare il mezzo DMEM dal fondo della piastra del pozzo 6 e aggiungere 1 mL di PBS sterile per risciacquare il fondo del pozzo.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente pbs pipettando senza toccare la parte centrale del pulsante corneosclerale. Rimuovere l'anello di vetro utilizzando forcep sterili e posizionarlo nel 5% Distel.</li>
	<li>Risciacquare delicatamente la parte superiore del pulsante corneosclerale con 1 mL di PBS due volte [facoltativo].</li>
	<li>Tenere il bordo del pulsante corneosclerale con forceps punta fine e staccarlo dall'agar sottostante.</li>
	<li>Trasferire la cornea in un tubo da 50 ml riempito con ghiaccio freddo 1-2 mL di PBS.</li>
	<li>Utilizzare un omogeneizzatore a punta fine per aerare la parte superiore della cornea infetta. Il tessuto non deve essere completamente liquidato. L'omogeneizzatore aiuta a staccare i batteri dall'epitelio corneale e dall'area tagliata.</li>
	<li>Vortice la cornea in PBS per alcuni secondi per mescolare il contenuto.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL dell'omogeneato a 180 μL di PBS ed eseguire diluizioni seriali in una piastra di pozzo 96.</li>
	<li>Diluire serialmente la sospensione a10-4 e 10-5 diluizione e pipetta 10 μL dell'omogeneato diluito con batteri su una piastra di agar del sangue. Incubare la piastra per 8 ore e contare il numero di CFU. Durante la prova dell'effetto degli antimicrobici, il fattore di diluizione appropriato deve essere raggiunto sperimentalmente.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-Resistant+Pseudomonas+aeruginosa+Keratitis+Risk+Factors,+Clinical+Characteristics,+and+Outcomes.">Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes.</a> Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).</li><li>Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratitis.">Keratitis.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm:+Potential+therapeutic+targets.">Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets.</a> Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).</li><li>Ersoy, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+a+Fundamental+Flaw+in+the+Paradigm+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing.">Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing.</a> EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).</li><li>Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-dependent+Induction+of+Transient+Antibiotic+Resistance:+A+Prelude+to+Treatment+Failure.">Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure.</a> EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).</li><li>Pinnock, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+rabbit+and+human+corneas+as+models+for+bacterial+and+fungal+keratitis.">Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).</li><li>Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transmission+from+contact+lenses+to+porcine+corneas:+An+ex+vivo+study.">Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li><li>Brothers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Impediment+of+Corneal+Cell+Migration.">Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (7), (2015).</li><li>Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Organotypic+Corneal+Model+of+Acute+Epithelial+Herpes+Simplex+Virus+Type+I+Infection.">Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li><li>Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-Defense+Mechanism+of+the+Ocular+Surfaces.">Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+porcine+corneal+endothelial+organ+culture+model+for+research+purposes.">Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Oh, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+Porcine+Cornea+for+Biomedical+Applications.">Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).</li><li>Shi, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protectively+Decellularized+Porcine+Cornea+versus+Human+Donor+Cornea+for+Lamellar+Transplantation.">Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation.</a> Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).</li><li>Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+porcine+eyeball+as+an+in-vitro+model+for+dry+eye.">Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).</li><li>Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Corneal+Organ+Culture+Model+for+Wound+Healing+Studies.">Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il principale motore alla base dello sviluppo di questo modello di cheratite utilizzando cornea suina ex vivo è quello di fornire ai ricercatori che sviluppano nuovi antimicrobici un modello rappresentativo in vitro per determinare più accuratamente l'efficacia antimicrobica nelle fasi precliniche. Ciò fornirà ai ricercatori coinvolti nello sviluppo di nuovi antimicrobici un maggiore controllo sulla progettazione e la formulazione dei farmaci nelle fasi preclinali, aumenterà il successo negli studi clinici, ridurrà...

Le infezioni corneali sono importanti cause di cecità e si verificano in proporzioni epidemiche nei paesi a basso e medio reddito. L'eziologia della malattia varia da regione a regione, ma i batteri rappresentano la grande maggioranza di questi casi. Pseudomonas aeruginosa è un importante agente patogeno che causa una malattia rapidamente progressiva. In molti casi, i pazienti sono lasciati con cicatrici stromali, astigmatismo irregolare, richiedono trapianto o, nel peggiore dei casi, perdono unocchio 1,2.
La cheratite batterica causata da P. aeruginosa è un'infezione oculare difficile da trattare, in particolare a causa della crescente comparsa di ceppi antimicrobici resistenti di P. aeruginosa. Nell'ultimo decennio, è diventato evidente che i test e lo sviluppo di nuovi trattamenti per le infezioni corneali, in generale, e quelli causati da Pseudomonas sp., in particolare, sono essenziali per combattere l'attuale tendenza nella resistenza agli antibiotici3.
Per testare l'efficacia di nuovi trattamenti per le infezioni corneali, i metodi microbiologici convenzionali in vitro sono un surrogato scadente a causa della differenza nella fisiologia batterica durante la coltura di laboratorio e durante le infezioni in vivo, nonché a causa della mancanza dell'interfaccia ospite4,5. I modelli animali in vivo, tuttavia, sono costosi e dispendiosi in termini di tempo, possono fornire solo un piccolo numero di repliche e sollevare preoccupazioni sul benessere degli animali.
In questo articolo, dimostriamo un modello di cheratite organotipica ex vivo semplice e riproducibile che può essere utilizzato per testare vari trattamenti per infezioni acute e croniche. Abbiamo usato P. aeruginosa per questo esperimento, ma il modello funziona bene anche con altri batteri e organismi come funghi e lieviti che causano cheratite.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31425-100mg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12899357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + glutamax</td>
			<td>SLS</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td>Homogeniser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not appplicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12664785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35x10mm CytoOne</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Weldricks pharmacy</td>
			<td>2122828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis

Quando si sviluppano nuovi antimicrobici, il successo delle sperimentazioni sugli animali dipende da un'accurata estrapolazione dell'efficacia antimicrobica dai test in vitro alle infezioni animali in vivo. I test in vitro esistenti in genere sopravvalutano l'efficacia antimicrobica in quanto la presenza del tessuto ospite come barriera di diffusione non è contabilizzata. Per superare questo collo di bottiglia, abbiamo sviluppato un modello corneale suino ex vivo di cheratite batterica usando Pseudomonas aeruginosa come organismo prototipico. Questo articolo descrive la preparazione della cornea suina e il protocollo per l'istituzione dell'infezione. Gli stampi in vetro su misura consentono una configurazione semplice della cornea per gli studi sulle infezioni. Il modello imita l'infezione in vivo poiché la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale. L'accertamento dell'infezione è verificato come un aumento del numero di unità di formazione della colonia valutate tramite conteggio delle piastre vitali. I risultati dimostrano che l'infezione può essere stabilita in modo altamente riproducibile nelle cornee ex vivo utilizzando il metodo qui descritto. Il modello può essere esteso in futuro per imitare la cheratite causata da microrganismi diversi da P. aeruginosa. Lo scopo finale del modello è quello di indagare l'effetto della chemioterapia antimicrobica sui progressi dell'infezione batterica in uno scenario più rappresentativo delle infezioni in vivo. In tal modo, il modello qui descritto ridurrà l'uso di animali per i test, migliorerà i tassi di successo negli studi clinici e, in ultima analisi, consentirà una rapida traduzione di nuovi antimicrobici in clinica.

Il design degli stampi in vetro è un'idea innovativa e originale, il cui utilizzo ci ha permesso di allevare il modello in modo coerente con problemi minimi/nessun problema di contaminazione. Gli stampi sono stati preparati da un soffiatore di vetro dell'Università di Sheffield sulla base di un progetto(Figura 1A). La configurazione sperimentale mantiene la forma convessa della cornea e trattiene i batteri sulla parte superiore dell'epitelio in cui avviene l'infezione (<strong class="xfig"...

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Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per impostare un modello suino ex vivo di cheratite batterica. Pseudomonas aeruginosa è usato come organismo prototipico. Questo modello innovativo imita l'infezione in vivo in quanto la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale.

Stabilire un modello di Cornea ex vivo suina per lo studio dei trattamenti farmacologici contro la cheratite batterica

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

establishing-porcine-ex-vivo-cornea-model-for-studying-drug

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.1K Views.  University of Sheffield. Questo articolo descrive un protocollo passo-passo per impostare un modello suino ex vivo di cheratite batterica. Pseudomonas aeruginosa è usato come organismo prototipico. Questo modello innovativo imita l'infezione in vivo in quanto la proliferazione batterica dipende dalla capacità del batterio di danneggiare il tessuto corneale.

Video: Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

Ricorrente cheratite erpetica Stromal in Mouse, un modello per lo studio HSK umano

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

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Immunologia e infezioni

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

Bioluminescent Imaging batterica<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Saggi per l&#39;individuazione di nuovi antivirali contro virus della Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modello di un attacco T-Cell Oligodendrocyte-diretto nel acute cervello fette

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Anticorpli uccisione test per valutare le risposte immunologiche contro batteri patogeni

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

Analisi multiscala della crescita batterica sotto trattamenti di stress

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.