저자는 체스터 필드의 엘리엇 아바토이르에게 돼지 눈을 제공해 준 것에 대해 감사드립니다. 유리 링은 셰필드 대학의 화학학과의 유리 송풍기 댄 잭슨 (Dan Jackson)의 설계를 기반으로 만들어졌습니다. 저자는 자금 조달을 위한 의학 연구 위원회 (MR/S004688/1)를 감사하고 싶습니다. 저자는 또한 각막 준비에 대한 기술적 인 도움을 샤날리 딕웰라 부인에게 감사드립니다. 저자는 사진 서식에 도움을 준 조나단 에머리 씨에게 감사드립니다.

Albino 실험실 토끼는 홈 오피스 승인 프로토콜에서 다른 계획된 실험 작업을 위해 실험실에서 희생되었습니다. 눈은 이 프로토콜에 사용되었기 때문에 그 연구 결과에 있는 실험적인 사용을 위해 필요하지 않았습니다.
1. 살균
<ol><li>중요 단계: 증류수에 디스텔의 5% (v/v) 용액에서 1h로 담그고, 브러시로 청소하고, 수돗물로 헹구고, 최소 2시간 동안 185°C의 오븐에서 멸균하여 모든 집게와 가위를 소독합니다.</li>
	<li>121°C에서 15분 동안 자동화하여 다른 모든 유리제품 및 시약을 살균하거나 제조업체의 지시에 따라 시약을 준비합니다. 클래스 II 미생물학 안전 캐비닛에서 다음과 같은 절차를 수행합니다.</li>
</ol>2. 샘플 컬렉션
<ol><li>돼지 눈의 컬렉션<ol>
<li>커다란 하얀 땅이 뿌리고, 햄프셔 멧돼지와 십자가가 사용되었다. 동물들은 전류에 깜짝 놀랐고, 눈은 2시간 후 아바토이르에서 방출되었다.</li>
		<li>중요 단계: 일단 에뉴클레오면, 멸균 인산염 완충식염(PBS) 용액으로 실험실로 눈을 옮겨 건조되는 것을 방지하고 도착하자마자 즉시 처리합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>토끼 눈의 컬렉션<ol>
<li>각막을 소비하고 멸균 PBS로 실험실로 보냅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 코네클레럴 버튼 준비
<ol><li>멸균 집게를 사용하여 안구주변의 조직을 잡고 페트리 접시로 옮으시다. 메스 블레이드 15번과 집게를 사용하여 페트리 접시에 안구 주위의 결막과 근육 조직을 제거합니다.</li>
	<li>시신경을 집게로 잡고 멸균 PBS로 채워진 0.5 L 항아리로 옮기면서 안구를 부드럽게 들어 올립니다.</li>
	<li>모든 눈이 주변 조직을 지워지면 멸균 집게를 사용하여 PBS에서 3 % (v / v) 포비도요오드로 채워진 또 다른 0.5 L 항아리로 이동하여 1 분 동안 둡니다.</li>
	<li>멸균 PBS와 다른 0.5 L 항아리에 안구를 전송합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 페트리 접시에 여전히 눈을 잡고 메스 블레이드 없음 10A로 각막 근처에서 잘라냅니다.</li>
	<li>중요 단계 : 절단의 가장자리를 잡고 각막을 둘러싼 약 3mm의 clera를 떠나 각막을 소비하기 위해 가위를 사용합니다. 가위의 날카로운 끝이 홍채 또는 코로이드 조직을 관통하지 않고 수프라 코로이드 공간에 있는지 확인합니다.</li>
	<li>집게로 코네클레랄 버튼을 잡고 다른 뾰족한 끝 집게를 사용하여 비경 조직을 부드럽게 분리합니다.</li>
	<li>남은 글로브에서 코네클레랄 버튼을 들어 올리고 12웰 플레이트에서 PBS의 1.5%(v/v) 포비도네 요오드 용액으로 잠시 헹구세요.</li>
	<li>부식성 버튼을 멸균 PBS로 채워진 또 다른 12 개의 우물 접시에 넣습니다.</li>
	<li>모든눈(최대 40개의 눈을 한 번에 권장)한후, 각 코네클레랄 버튼을 개별 페트리 접시(직경 34mm)에 놓고 3mL의 배양 배지를 3mL로 미리 데워 3mL로 부어 37°C로 미리 데워버로 한다. 참고: 배양 매체의 구성은 다음과 같습니다: 덜벡코의 수정된 독수리 의 매체 (DMEM): 햄의 [1:1] 5 μg(@mL-1 인슐린 과 10 ng∙mL-1 표피 성장 인자 (EGF), 10% (v/v) 태아 송아지 혈청 (FCS),100 Upenill 100 U∙mL-1 연쇄상 구균 및 2.5 μg∙mL-1 암포테리신 B. 선택적 단계로, 배지는 추가 인큐베이션 단계 동안 절제된 각막의 부종을 방지하기 위해 50g∙L-1 dextran으로 보충될 수 있다.</li>
	<li>가습 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.</li>
</ol>4. 코네클레럴 버튼 의 유지 보수
<ol><li>24 시간 후에, 매체를 제거하고 항생제를 포함하는 신선한 미리 온전한 문화 매체의 3 mL로 대체하기 위하여 무균 기술을 사용합니다. 각막을 소독하기 위해 48 h에 대한 항생제로 미디어에 코네클레랄 버튼을 유지합니다. 가습 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>중요 단계: 48시간 후에 미디어를 제거하고 PBS 2mL로 각막을 헹구세요. 그런 다음 실험 감염 전에 최소 2 일 또는 이상적으로 3 일 동안 항생제없는 매체에 코네클레랄 버튼을 보관하여 조직에서 잔류 항생제를 제거하십시오.</li>
	<li>가습 조직 배양 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 이 3일 이내에 미디어를 하나 이상 변경합니다. 어떤 탁도항생제없는 매체에서 발전하는 경우에 각막을 폐기하십시오.</li>
</ol>5. 접종 준비
<ol><li>LB 국물 10mL를 50mL 원추형 플라스크에 거품 스토퍼로 붓습니다.</li>
	<li>P. aeruginosa 균주 PAO1 또는 변형 PA14의 식민지를 신선한 한천 판에서 전송하고 박테리아가 중간 로그 단계에 될 때까지 3-4 시간 동안 37 °C에서 배양한다.</li>
	<li>5분 동안 3,000 x g에서 50mL 튜브 및 원심분리기로 박테리아의 배양을 옮긴다. 상체를 제거하고 PBS에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>5.3을 반복하여 세포를 세척합니다. PBS에서 셀 펠릿을 다시 일시 중단하고 멸균 PBS를 공백으로 사용하여 600 nm에서 약 0.6으로 광학 밀도를 조정합니다.</li>
</ol>6. 코네클레럴 버튼 감염
<ol><li>페트리 접시에서 미디어를 제거하고 멸균 PBS 1mL로 각막을 두 번 헹구습니다.</li>
	<li>각막을 그 사이에 들고 있는 동안 집게를 부드럽게 짜냅니다. 10A 메스를 사용하여 상피 층을 통해 상피 층에서 기본 스트로마에 대한 진피성 버튼의 중앙 섹션에서 두 개의 수직, 2 개의 수평 의 네 컷을 만듭니다.</li>
	<li>멸균 유리 몰드를 6웰 플레이트에 놓고 넓은 부분을 위로 놓고 각막을 유리 금형 의 중간에 놓고 상피 쪽을 아래로 향합니다. 유리 금형의 하단 부분의 중앙에 절단을 바로 만듭니다.</li>
	<li>임계 단계: DMEM에 용해된 1mL(w/v) 낮은 융점 한천을 부어 유리 금형을 각막으로 완전히 채웁니다.</li>
	<li>각막 상피가 위쪽으로 향하도록 한천을 설정한 다음 유리 금형을 반전시키십시오.</li>
	<li>오드600nm = 0.6(P. aeruginosa의 경우 15 μL에서 약 1x 107 콜로니 형성 유닛(CFU)에 해당되는 세균 배양의 파이펫 15 μL을 절단 부위에 직접 넣은 다음, 각막 에피텔륨 모이를 유지하기 위해 85μL의 PBS를 상단에 추가한다. 무접종을 위한 식민지 형성 단위를 계산하기 위하여 천원에 남아 있는 세균 배양 및 접시를 희석합니다.</li>
	<li>유리 금형과 함께 각 우물의 바닥에 항생제없이 DMEM 1 mL을 추가합니다. 감염된 코네오클레럴 버튼으로 6웰 플레이트를 37°C의 가습된 인큐베이터에 최대 24시간 동안 5%CO2로 배양한다.</li>
	<li>모든 실험과 함께 감염되지 않은 대조군 각막을 설정합니다. 감염되지 않은 제어를 설정하려면 6.6 단계에서 세균 배양의 15 μL을 멸균 PBS로 대체하십시오.</li>
</ol>7. 박테리아를 수확하기 위해 각막의 균질화
<ol><li>6웰 플레이트의 바닥에서 DMEM 배지를 버리고 멸균 PBS 1mL을 추가하여 우물의 바닥을 헹구십시오.</li>
	<li>코네클레럴 버튼의 중앙 부분을 만지지 않고 파이프팅으로 PBS를 부드럽게 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 유리 링을 제거하고 5 % 디스텔에 놓습니다.</li>
	<li>부드럽게 PBS의 1 mL [선택 사항]로 코네클레럴 버튼의 상단을 헹구십시오.</li>
	<li>미세 한 팁 집게와 코네클레럴 버튼의 가장자리를 잡고 아래 의 한천에서 분리.</li>
	<li>각막을 PBS의 얼음 차가운 1-2 mL로 채워진 50 mL 튜브로 옮춥춥습니다.</li>
	<li>감염된 각막의 상단을 깎아 미세 한 팁 균질화제를 사용합니다. 조직은 완전히 청산 될 필요가 없습니다. 균질화는 각막 상피와 절단 영역에서 박테리아를 분리하는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>내용내용을 혼합하기 위해 몇 초 동안 PBS에서 각막을 소용돌이.</li>
	<li>PBS의 180 μL에 균주 20 μL을 추가하고 96 웰 플레이트에서 직렬 희석을 수행합니다.</li>
	<li>희석된 균주형의 현탁액을10-4 및10-5 희석 및 파이펫 10 μL로 혈액 천막판에 박테리아로 희석하였다. 접시를 8시간 동안 배양하고 CFU 수를 계산합니다. 항균제의 효과를 테스트할 때 적절한 희석 계수는 실험적으로 도착해야 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Vazirani, J., Wurity, S., Ali, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidrug-Resistant+Pseudomonas+aeruginosa+Keratitis+Risk+Factors,+Clinical+Characteristics,+and+Outcomes.">Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Keratitis Risk Factors, Clinical Characteristics, and Outcomes.</a> Ophthalmology. 122 (10), 2110-2114 (2015).</li><li>Sharma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratitis.">Keratitis.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 419-444 (2001).</li><li>Sharma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilm:+Potential+therapeutic+targets.">Pseudomonas aeruginosa biofilm: Potential therapeutic targets.</a> Biologicals. 42 (1), 1-7 (2014).</li><li>Ersoy, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correcting+a+Fundamental+Flaw+in+the+Paradigm+for+Antimicrobial+Susceptibility+Testing.">Correcting a Fundamental Flaw in the Paradigm for Antimicrobial Susceptibility Testing.</a> EBioMedicine. 20, 173-181 (2017).</li><li>Kubicek-Sutherland, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-dependent+Induction+of+Transient+Antibiotic+Resistance:+A+Prelude+to+Treatment+Failure.">Host-dependent Induction of Transient Antibiotic Resistance: A Prelude to Treatment Failure.</a> EBioMedicine. 2 (9), 1169-1178 (2015).</li><li>Pinnock, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+rabbit+and+human+corneas+as+models+for+bacterial+and+fungal+keratitis.">Ex vivo rabbit and human corneas as models for bacterial and fungal keratitis.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 255 (2), 333-342 (2017).</li><li>Harman, R. M., Bussche, L., Ledbetter, E. C., Van de Walle, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Characterization+of+an+Air-Liquid+Canine+Corneal+Organ+Culture+Model+To+Study+Acute+Herpes+Keratitis.">Establishment and Characterization of an Air-Liquid Canine Corneal Organ Culture Model To Study Acute Herpes Keratitis.</a> Journal of Virology. 88 (23), 13669-13677 (2014).</li><li>Madhu, S. N., Jha, K. K., Karthyayani, A. P., Gajjar, D. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Caprine+Model+to+Study+Virulence+Factors+in+Keratitis.">Ex vivo Caprine Model to Study Virulence Factors in Keratitis.</a> Journal of Ophthalmic &amp; Vision Research. 13 (4), 383-391 (2018).</li><li>Vermeltfoort, P. B. J., van Kooten, T. G., Bruinsma, G. M., Hooymans, A. M. M., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+transmission+from+contact+lenses+to+porcine+corneas:+An+ex+vivo+study.">Bacterial transmission from contact lenses to porcine corneas: An ex vivo study.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 46 (6), 2042-2046 (2005).</li><li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas.">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li><li>Brothers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Impediment+of+Corneal+Cell+Migration.">Bacterial Impediment of Corneal Cell Migration.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 56 (7), (2015).</li><li>Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Organotypic+Corneal+Model+of+Acute+Epithelial+Herpes+Simplex+Virus+Type+I+Infection.">Ex vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li><li>Sack, R. A., Nunes, I., Beaton, A., Morris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-Defense+Mechanism+of+the+Ocular+Surfaces.">Host-Defense Mechanism of the Ocular Surfaces.</a> Bioscience Reports. 21 (4), 463-480 (2001).</li><li>Kunzmann, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+porcine+corneal+endothelial+organ+culture+model+for+research+purposes.">Establishment of a porcine corneal endothelial organ culture model for research purposes.</a> Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).</li><li>Oh, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+Porcine+Cornea+for+Biomedical+Applications.">Processing Porcine Cornea for Biomedical Applications.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 15 (4), 635-645 (2009).</li><li>Shi, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protectively+Decellularized+Porcine+Cornea+versus+Human+Donor+Cornea+for+Lamellar+Transplantation.">Protectively Decellularized Porcine Cornea versus Human Donor Cornea for Lamellar Transplantation.</a> Advanced Functional Materials. 29, 1902491-1902503 (2019).</li><li>Menduni, F., Davies, L. N., Madrid-Costa, D., Fratini, A., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+porcine+eyeball+as+an+in-vitro+model+for+dry+eye.">Characterisation of the porcine eyeball as an in-vitro model for dry eye.</a> Contact Lens &amp; Anterior Eye. 41 (1), 13-17 (2018).</li><li>Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Corneal+Organ+Culture+Model+for+Wound+Healing+Studies.">Ex vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

전 생체 돼지 각막을 이용한 이 각막염 모델의 개발의 주된 원동력은 임상 전 단계에서 항균 효능을 보다 정확하게 결정하기 위해 체외 모델을 대표하는 새로운 항균제 개발 연구원을 제공하는 것이다. 이것은 새로운 항균제 개발에 관여하는 연구원을 제공 할 것입니다 전 임상 단계에서 약물 디자인 및 제형에 대한 더 큰 제어, 임상 시험에서 성공을 증가, 대상 연구를 가능하게하여 동물의 사용?...

각막 감염은 실명의 중요한 원인이며 저소득 및 중간 소득 국가에서 전염병 비율에서 발생합니다. 질병의 병인학은 지역마다 다르지만 박테리아는 이러한 경우의 대부분을 차지합니다. 슈도모나스 아에루기노사는 급속하게 진보적인 질병을 일으키는 원인이 되는 중요한 병원체입니다. 많은 경우에, 환자는 기질 흉터, 불규칙한 난시로 남아, 이식을 요구하거나 최악의 시나리오에서, 눈1을잃고1,2.
P. aeruginosa에 기인한 세균성 각질염은 P. aeruginosa의항균 저항긴장의 증가 출현 때문에 특히 취급하기 어려운 눈 감염입니다. 지난 10 년 이내에, 각막 감염에 대한 새로운 치료법을 테스트하고 개발하는 것이 명백해졌으며, 일반적으로 슈도모나스 스프에 의해 유발된 치료법은 특히 항생 저항3의현재 추세에 대처하는 데 필수적입니다.
각막 감염에 대한 새로운 치료법의 효능을 시험하기 위해, 기존의 체외 미생물 방법은 실험실 배양 중 및 생체 내 감염 시 세균성 생리학의 차이로 인해 대리가 좋지 않은 반면, 호스트 인터페이스4,5의부족으로 인한 것이다. 그러나 생체 내 동물 모델은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 소수의 복제본만 전달하고 동물 복지에 대한 우려를 제기할 수 있습니다.
이 기사에서는 급성 및 만성 감염에 대한 다양한 치료를 테스트하는 데 사용할 수있는 각질염의 간단하고 재현 가능한 organotypic ex vivo 돼지 모델을 시연합니다. 우리는 이 실험을 위해 P. aeruginosa를 사용했습니다 그러나 모형은 또한 다른 박테리아및 각질염을 일으키는 원인이 되는 균류 및 효모와 같은 유기체와 잘 작동합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Falcon tube</td>
			<td>SLS</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellstar 12 well plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31425-100mg-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12899357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + glutamax</td>
			<td>SLS</td>
			<td>D0819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Oven Incubator</td>
			<td>SLS</td>
			<td>OVe1020</td>
			<td>Sterilising oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal growth factor</td>
			<td>SLS</td>
			<td>E5036-200UG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 HAM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N4888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal calf serum</td>
			<td>Labtech International</td>
			<td>CA-115/500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15307805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15575809</td>
			<td>Homogeniser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell VIOS 160i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15373212</td>
			<td>Tissue culture incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Megafuge 16R</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2242</td>
			<td>Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin, recombinant Human</td>
			<td>SLS</td>
			<td>91077C-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron</td>
			<td>Infors</td>
			<td>Not appplicable</td>
			<td>Bacterial incubator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>SLS</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12664785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35x10mm CytoOne</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Weldricks pharmacy</td>
			<td>2122828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe 2020</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1284804</td>
			<td>Class II microbiology safety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade number 15</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Swann Morton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11849002</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishing a porcine ex vivo cornea model for studying drug treatments against bacterial keratitis

새로운 항균제가 개발될 때, 동물 실험의 성공은 생체 외 실험에서 생체 내 동물 감염에 항균 효능의 정확한 외삽에 달려 있습니다. 기존 시험관내 시험은 전형적으로 확산 장벽으로서 숙주 조직의 존재가 고려되지 않기 때문에 항균 효능을 과대 평가한다. 이 병목 현상을 극복하기 위하여는, 우리는 초원 유기체로 슈도모나스 aeruginosa를 사용하여 세균 각질염의 전 생체 돼지 각막 모형을 개발했습니다. 이 문서에서는 감염의 확립을 위한 돼지 각막 및 프로토콜의 준비를 설명합니다. 맞춤형 유리 금형은 감염 연구를 위해 각막의 간단한 설정을 가능하게 합니다. 이 모델은 세균성 증식이 각막 조직을 손상시키는 박테리아의 능력에 따라 생체 내 감염을 모방합니다. 감염의 확립은 실행 가능한 플레이트 수를 통해 평가된 식민지 형성 단위의 수의 증가로 확인됩니다. 결과는 여기에 설명된 방법을 사용하여 전 생체 내 각막에서 매우 재현 가능한 방식으로 감염이 확립될 수 있음을 보여준다. 이 모델은 P. aeruginosa이외의 미생물에 의한 각질염을 모방하기 위해 미래에 확장 될 수있다. 모델의 궁극적인 목표는 생체 내 감염을 더 대표하는 시나리오에서 세균 감염의 진행에 항균 화학 요법의 효과를 조사하는 것입니다. 이렇게함으로써, 여기에서 기술된 모형은 시험을 위한 동물의 사용을 감소시키고, 임상 시험에서 성공률을 향상하고 궁극적으로 병원에 새로운 항균제의 급속한 번역을 가능하게 할 것입니다.

유리 금형의 디자인은 혁신적이고 독창적 인 아이디어이며, 이를 통해 오염에 대한 최소한의 문제 / 전혀 문제가없는 일관된 방식으로 모델을 설정할 수 있었습니다. 금형은설계(그림 1A)에기초하여 셰필드 대학의 유리 송풍기로 제조하였다. 실험용 설정은 각막의 볼록 모양을 유지하고 감염이 발생하는 상피의 상단에 박테리아를 보유합니다(도1B).
...

Watch this Scientific Journal Video about Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis at JoVE.com

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

이 문서에서는 세균 성 각질염의 전 생체 돼지 모델을 설정하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 슈도모나스 아에루기노사는 대생 유기체로 사용된다. 이 혁신적인 모델은 세균성 증식이 각막 조직을 손상시키는 박테리아의 능력에 달려 있기 때문에 생체 내 감염을 모방합니다.

세균성 각막염에 대하여 약 처리를 공부하기 위한 돼지 Ex Vivo Cornea 모형 을 설치합니다

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

establishing-porcine-ex-vivo-cornea-model-for-studying-drug

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

5.1K 조회수.  University of Sheffield. 이 문서에서는 세균 성 각질염의 전 생체 돼지 모델을 설정하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 슈도모나스 아에루기노사는 대생 유기체로 사용된다. 이 혁신적인 모델은 세균성 증식이 각막 조직을 손상시키는 박테리아의 능력에 달려 있기 때문에 생체 내 감염을 모방합니다.

비디오: Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical visits each year for treatment. Between 1 and 2 percent of those patients with clinical disease will experience loss of vision of the infected cornea. The vast majority of these cases are the result of reactivation of a latent infection by herpes simplex type I virus and not due to acute disease. Interestingly, the acute infection is the model most often used to study this disease. However, it was felt that a recurrent model of HSK would be more reflective of what occurs during clinical disease. The recurrent animal models for HSK have employed both rabbits and mice. The advantage of rabbits is that they experience reactivation from latency absent any known stimulus. That said, it is difficult to explore the role that many immunological factors play in recurrent HSK because the rabbit model does not have the immunological and genetic resources that the mouse has. We chose to use the mouse model for recurrent HSK because it has the advantage of there being many resources available and also we know when reactivation will occur because reactivation is induced by exposure to UV-B light. Thus far, this model has allowed those laboratories using it to define several immunological factors that are important to this disease. It has also allowed us to test both therapeutic and vaccine efficacy.

Most studies of herpetic corneal disease use a primary infection model. However, primary infection with HSV-1 does not typically lead to human disease. Here we describe a recurrent model of herpetic corneal disease, which more closely mimics human disease.

마우스의 재발 포진 성 각막염 Stromal, 인간 HSK 유학을위한 모델

Herpetic eye disease, termed herpetic stromal keratitis (HSK), is a potentially blinding infection of the cornea that results in over 300,000 clinical ...

연구

면역학 및 감염병학

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

발광 생물 세균 이미징<em&gt; 생체 내</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

Bluetongue 바이러스에 대한 항 바이러스제 소설의 식별에 대한 분석

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

<em&gt; 생체 내</em&gt; 급성 뇌 조각의 희소 돌기 아교 세포 지시 T 세포 공격의 모델

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

높은 처리량 정량 실시간 RT-PCR 분석 유형 I과 III 인터페론 하위 유형의 발현 양상을 결정하는

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

생체 외 및 생체 내 모델에서 혈관 벽에서 흐름 조건에 세균 부착을 연구하기 위해

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to characterize the response of bacterial cells to stress-inducing treatments such as exposure to antibiotics or other antimicrobial compounds, irradiation, non-physiological pH, temperature, or salt concentration. Different stress treatments might disturb different cellular processes, including cell division, DNA replication, protein synthesis, membrane integrity, or cell cycle regulation. These effects are usually associated with specific phenotypes at the cellular scale. Therefore, understanding the extent and causality of stress-induced growth or viability deficiencies requires a careful analysis of several parameters, both at the single-cell and at the population levels. The experimental strategy presented here combines traditional optical density monitoring and plating assays with single-cell analysis techniques such as flow cytometry and real time microscopy imaging in live cells. This multiscale framework allows a time-resolved description of the impact of stress conditions on the fate of a bacterial population.

This protocol allows a time-resolved description of bacterial growth under stress conditions at the single-cell and the cell population levels.

스트레스 치료하에 세균 성장의 다단계 분석

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.