Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (DK097335 & T32AI007260) und der University of Iowa Stead Family Department of Pediatrics unterstützt.

Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Iowa (Protocol #8041401) genehmigt. Alle Tiere wurden in einer Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) zugelassenem Vivarium an der Universität von Iowa untergebracht. Alle Mäuse waren Wildtyp-Stamm C57Bl/6J.
1. Etablierung von FEMI bei trächtigen Mäusen
<ol><li>LPS-Vorbereitung<ol>
<li>Verwenden Sie LPS aus Escherichia coli O55:B5 (Lagerkonzentration 2 mg/ml).</li>
		<li>LpS-Lagerkonzentration 1:100 mit steriler Saline für eine Arbeitskonzentration von 20 g/ml verdünnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mütterliche LPS-Injektion<ol>
<li>Injizieren Sie schwangere Muttern am Trächtigkeitstag e15. Dieser Zeitpunkt beträgt etwa 75% durch die murine Schwangerschaft, was dieses Modell entwicklungsähnlich dem frühen dritten Trimester von menschlichen Schwangerschaften macht, das ist, wenn die Mehrheit der Frühgeburten aufgrund von Chorioamnionitis auftreten.</li>
		<li>Wiegen Sie schwangere Mäuse unmittelbar vor der Injektion, um eine geeignete LPS-Dosierung zu bestimmen.</li>
		<li>Berechnen Sie die Dosis der Arbeitskonzentration nach folgender Formel: 5 l x Gramm Körpergewicht (gbw), für eine Gesamtdosis von LPS von 100 g/kg. Verwenden Sie für Kontrolltiere ein äquivalentes Volumen normaler Saline zur Injektion.</li>
		<li>Vortex LPS Lösung dreimal für 15 Sekunden auf hoch vor jeder Injektion.</li>
		<li>LPS-Volumen in eine 1 ml Spritze aufteilen.</li>
		<li>Halten Sie schwangere Maus mit Scruffing-Technik. Halten Sie in dorsaler Recumbency-Position und führen Sie die Injektion durch.<ol>
<li>Legen Sie eine 30 Gauge 8 mm Nadelabschrägung über dem rechten unteren Quadranten des Bauches (um Blase und Bauchgefäße zu vermeiden) in einem Winkel von 30 bis 201240° ein. Legen Sie etwa 1/4 bis 1/2 die Länge der Nadel ein.</li>
			<li>Ziehen Sie den Spritzenkolben zurück, um vor der Injektion einen Unterdruck zu gewährleisten. Fahren Sie mit der Injektion fort, wenn ein Unterdruck vorliegt.</li>
			<li>Nach der Injektion, beobachten Sie Mäuse für ca. 30 min und kehren dann für den Rest der Schwangerschaft in Die Käfige zurück.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Lieferung und Pflege des Nachwuchses und Darmernte
<ol><li>Liefern Sie Welpen normalerweise über vaginale Lieferung bei e20. HINWEIS: Dieses Modell hat eine erwartete dosisabhängige fetale Verlustrate, die in Abbildung 1 zu sehen ist und in den folgenden Ergebnissen erläutert wird.</li>
	<li>Lassen Sie Welpen bei Müttern bleiben und erhalten Ad libitum Feeds.</li>
	<li>Am Tag der Ernte, typischerweise am 14. Tag (P14), werden Welpen durch Zervixdislokation in Übereinstimmung mit den Protokollen des Institutional Animal Care and Use Committee eingeschläfert.</li>
	<li>Mit Schere und Zange, machen einen vertikalen Schnitt nach unten die Mittellinie des Bauches, durch die Haut und Peritoneum, für die gesamte Länge des Bauches. Den Dünndarm mit der Schere vom Magen zum Cecum verbrauchen und das Mesentery mit Zangen entfernen.</li>
	<li>Isolieren und halten Sie die distalen 1/3 des Dünndarms (Abschnitt repräsentativ für menschliches Ileum), werfen sie den proximalen Dünndarm, das Cecum und den Dickdarm.</li>
	<li>Teilen Sie den Ileum-Anteil mit einer Schere in die Hälfte.</li>
	<li>Legen Sie die proximale Hälfte in eine RNA-Stabilisierungslösung für die spätere RNA-Quantifizierung.</li>
	<li>Legen Sie die distale Hälfte in 10% neutral gepuffertes Formalin für die Folienvorbereitung.</li>
</ol>3. Darmverletzung Scoring
<ol><li>Schnitt Paraffin eingebettet Gewebe in 5 'm dicke Scheiben und montieren auf Glasrutschen. HINWEIS: Wir senden die Proben an einen Histologiekern für Paraffineinbettung, Schnitt und Montage auf Dias.</li>
	<li>Deparaffinisieren Sie Dias nach Standardverfahren.</li>
	<li>Fleckenabschnitte mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardverfahren.</li>
	<li>Punkteabschnitte auf einer 3-Punkte-Skala für Darmverletzungen wie zuvor beschrieben42,43.<ol>
<li>Bewerten Sie mit Hilfe der Lichtmikroskopie die generalisierte Darmverletzung durch zwei getrennte blinde Forscher auf einer 3-Punkte-Skala, in der die Villusintegrität und die Trennung von der Kellermembran43 (Ergänzende Abbildung 1) bewertet werden. Darmverletzungen werden am besten bei 20-facher Vergrößerung und numerischer Blende 0,50 beurteilt.</li>
		<li>Weisen Sie eine Punktzahl von 0 zu, um die normale Schleimhaut zu beschreiben.</li>
		<li>Weisen Sie eine Punktzahl von 1 beschreiben leichte Verletzungen, die die Entwicklung von subepithelialen Grünhagen Raum, Vakuolisierung oder subepitheliale Heben beschränkt auf die Lamina propria oder Spitzen von Villi umfasst.</li>
		<li>Weisen Sie eine Punktzahl von 2 zu, um schwere Verletzungen zu beschreiben, die durch epitheliale Hebung und Vakuolisierung von mehr als der Hälfte der Zotten-, Zottenverzerrung oder Schleimhautulzerung und Desintegration der Laminapropria angezeigt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantifizierung von Paneth- und Kelchenzellen
<ol><li>Nach der Deparaffinierung, Flecken diagletten von Gewebeabschnitten aus Schritt 2.8 mit Alcian Blue/Periodic Acid Schiff Fleck, um sowohl Kelchen und Paneth Zellen wie zuvor beschrieben44,45 nach den folgenden Schritten zu bezeichnen. HINWEIS: Während Alcian Blue/Periodic Acid Schiff Fleck ist nicht spezifisch für Paneth oder Kelche Zellen, unserer Erfahrung nach, blinde erfahrene Forscher haben gleichwertige zelluläre Quantifizierung mit diesem Fleck im Vergleich zu zellulären gezielten Antikörpern, mit deutlich weniger Hintergrundfärbung46.</li>
	<li>Deparaffinisieren, Flecken, und dehydrieren gleitet wie folgt.<ol>
<li>Zweimal 10 min in Xylol untertauchen. VORSICHT: Xylol sollte in einer Dunstabzugshaube verwendet werden.</li>
		<li>Spülen Sie mit 100% EtOH.</li>
		<li>Untertauchen Sie Dias in 100 % EtOH für 3 min, dann in 90% EtOH für 3 min, gefolgt von 70% EtOH für 3 min, und schließlich tauchen Dias in 50% EtOH für 3 min.</li>
		<li>Waschen Sie unter fließendem Leitungswasser für 5 min. VORSICHT: Zeigen Sie den Abschnitt vom fließenden Wasser weg, um den Verlust der Gewebeprobe zu verhindern.</li>
		<li>Filter Alcian blau Fleck Lösung mit einem Standard-Kaffeefilter.</li>
		<li>Fleck gleitet in Alcian blauen Fleck für 15 min und dann unter fließendem Leitungswasser für 2 min waschen.</li>
		<li>1 mg Periodensäure in 200 ml doppelt destilliertem Wasser verdünnen. Untertauchen Sie Dias in dieser Lösung für 5 min. Dann unter fließendem Leitungswasser für 1 min waschen.</li>
		<li>Mit Schiff-Reagenz 10 min färben. Waschen Sie unter fließendem Leitungswasser für 5 min.</li>
		<li>Die Dias mit Hämatoxylin 1 min beflecken und dann 2 min unter fließendem Leitungswasser waschen.</li>
		<li>Untertauchen Sie sie in sauren Alkohol (1 ml Salzsäure gemischt in 99 ml von 70% EtOH) für 1 min.</li>
		<li>In Scotts Leitungswasser (0,1% Konzentration von NaHCO3 in Leitungswasser) für 1 min untertauchen und dann 1 min unter fließendem Leitungswasser waschen.</li>
		<li>Dehydrieren Sie die Dias.<ol>
<li>Tauchen Sie jede Rutsche 10 Mal in 70% EtOH, dann tauchen Sie 10 mal in 90% EtOH, und 10 mal in 100% EtOH.</li>
			<li>Untertauchen Sie diagleitet in 100% EtOH für 10 min, gefolgt von dem Tauchen zweimal in frisches Xylol für jeweils 3 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legen Sie einen Tropfen Montagemedium auf das Exemplar und legen Sie einen Deckeldarüberabschlag darüber.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Goblet-Zellzählung<ol>
<li>Mit Hilfe der Lichtmikroskopie Kelchenzellen zählen (Ergänzende Abbildung 2). Für jedes Stück Darmgewebe zählen Sie die Anzahl der Kelchenzellen und 500 Epithelzellen und exprimieren Sie das Kelchenzellverhältnis als Verhältnis pro 100 Epithelzellen. Kelchzellen werden am besten bei 20-facher Vergrößerung und numerischer Blende 0,5 gezählt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paneth-Zellzählung<ol>
<li>Mit Hilfe der Lichtmikroskopie panegieren Sie Paneth-Zellen (Ergänzende Abbildung 2). Für jedes Stück Darmgewebe, Exprimieren als Verhältnis von Paneth-Zellen pro Darmkrypta. Zählen Sie 100 Darmkrypten pro Stück Darmgewebe. Paneth-Zellen werden am besten bei 20x-60x Vergrößerung und numerischer Blende 0.50-1.30 gezählt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Chorioamnionitis wirkt sich auf 2-u20124% der Laufzeit und 25-u201230% der Frühlieferungen8,9. Jedoch, die Auswirkungen der Chorioamnionitis kann lange nach der Geburt verlängern, da es gezeigt hat, dass signifikante Auswirkungen auf den Fötus und Neugeborenen10,11,12,13,14,<sup class="xr...

Die Chorionmembranen spielen eine wesentliche Rolle bei der Hautschwangerschaft. Dazu gehören die Chorion und Amnion, die mehrere Funktionen erfüllen. Sie umgeben und schützen den Fötus, erleichtern die parakrine Signalisierung zwischen dem mütterlichen und dem fetalen Kompartiment1und erstellen lokale Rückkopplungsschleifen innerhalb der Chorionmembranen, die an der Initiierung der Parturition1beteiligt sein können. Das aktuelle Verständnis der Membranen deutet darauf hin, dass das Amnion eine strukturelle Barrierefunktion bietet, und die Chorion bietet einen immunologischen Puffer, der in erster Linie den sich entwickelnden Fötus vor dem mütterlichen Immunsystem schützt2. Entzündung dieser Membranen ist bekannt als Chorioamnionitis. Historisch gesehen wurde die Diagnose der klinischen Chorioamnionitis nach dem Vorhandensein von mütterlichem Fieber plus einem oder mehreren fetalen oder mütterlichen klinischen Befunden3,4gemacht. Obwohl diese Definition klinisch nützlich ist, hat ihre mangelnde Präzision die Chorioamnionitis-Forschung zu einer Herausforderung gemacht. Im Jahr 2015 definierte ein Experten-Panel-Workshop des Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development Chorioamnionitis als intrauterine Entzündung oder Infektion oder beides (Triple I)3. Diese Klärung ist wichtig, weil, während mikrobielle induzierte Infektion ist eine wichtige Ursache für Gebärmutter/Amnion-Entzündung, es tritt seltener als sterile Gebärmutter/Amniotische Entzündung5,6,7. Insgesamt bleibt die Chorioamnionitis ein erhebliches Problem der öffentlichen Gesundheit, wie sie in 2-u20124% der Laufzeitlieferungen und 25-u201230% der Frühlieferungen8,9gesehen wird.
Chorioamnionitis kann signifikante Auswirkungen auf den Fötus und Neugeborenen haben. Es ist in der Literatur gut dokumentiert, dass Chorioamnionitis mit einem erhöhten Risiko für viele der Morbiditäten der Frühreife verbunden ist, einschließlich bronchopulmonaler Dysplasie10, zerebrale weiße Materie Verletzung11, intraventrikuläre Blutung12, Retinopathie der Frühreife13, und sowohl vermutet und bestätigt früh einsetzte neonatale Sepsis14,15. Da wir an Verletzungs- und Reparaturmechanismen des unreifen Darmtraktes interessiert sind, ist es wichtig zu beachten, dass Chorioamnionitis auch mit der späteren Entwicklung der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC)15,16verbunden ist. NEC ist eine verheerende Magen-Darm-Erkrankung von Frühgeborenen, die zu einer dysregulierten Wirtsreaktion auf Entzündungen und anschließende Darmnekrose17führt. Jedes Jahr betrifft NEC über 4000 Säuglinge in den Vereinigten Staaten, und bis zu einem Drittel dieser Säuglinge sterben an der Krankheit18. Die Pathogenese von NEC beinhaltet wahrscheinlich eine Kombination von Darmunreife, Dysregulation des unreifen Immunsystems, Darmentzündung, und bakterielle Translokation19, die in einem letzten gemeinsamen Weg der Darmnekrose gipfelt. Wichtig ist, dass der Beginn von NEC oft Wochen nach der Geburt und eine mögliche Exposition gegenüber Chorioamnionitis auftritt, was die mechanistische Verbindung zwischen Chorioamnionitis und der anschließenden Entwicklung von NEC unklarmacht 20. Ein potenzieller Mechanismus, durch den Chorioamnionitis zur Pathophysiologie von NEC beitragen kann, ist durch Upregulation des mütterlichen Immunsystems, die anschließend eine starke fetale Entzündungsreaktion produziert, die normale fetale Entwicklungsmuster stören kann21,22,23.
Mehrere Säugetiermodelle der Chorioamnionitis existieren bei Nagetieren und Schafen24,25,26,27,28,29,30,31,32. Es liegen jedoch nur wenige Daten über die Entwicklung des Darmtraktes nach der ersten Neugeborenenperiode nach der Chorioamnionitis-induzierten fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung (FEMI) vor. Um den Zusammenhang zwischen FEMI und der anschließenden Entwicklung der Verletzung des unreifen Darmtraktes zu untersuchen, haben wir das Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte FEMI-Modell angepasst. Lipopolysaccharide sind ein wichtiger Bestandteil der extrazellulären Oberfläche auf gramnegativen Bakterien und sind ein starkes Stimulans des angeborenen Immunsystems mehrerer eukaryotischer Arten, einschließlich Menschen33. Die mütterliche LPS-Injektion führt zu einer sterilen entzündlichen Kaskade ohne die verwirrenden Wirkungen lebender Bakterien, und es ist ein etabliertes Modell für die Induktion der Frühgeburt34, sowie ein Modell der akuten Chorioamnionitis und des fetalen Entzündungsreaktionssyndroms (FIRS), das die schwerste Form der Chorioamnionitis24,35ist. Es hat sich auch gezeigt, dass sowohl zerebrale weiße und graue Materie Verletzung in einem Schaf Modell36 und ein murines Modell37,38,39,40induzieren. Unserer Kenntnis nach sind wir jedoch die ersten, die dieses Modell der Chorioamnionitis und FEMI verwenden, um seine Auswirkungen auf die Entwicklung des Magen-Darm-Traktes nach der Geburt zu untersuchen und einen möglichen mechanistischen Zusammenhang zwischen Chorioamnionitis und späterer Entwicklung von NEC41,42zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>Newcomer supply</td>
			<td>1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin stain</td>
			<td>Leica</td>
			<td>381562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-U Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>2CE-MQVJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>H5106</td>
			<td>CAS# 10450-59-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Am7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#39;s reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secor Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Discovery (MSD)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Plex Assay</td>
			<td>Meso Scale Discovery (MSD)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of fetal exposure to maternal inflammation to study the effects of acute chorioamnionitis on newborn intestinal development

Chorioamnionitis ist ein häufiges Ausfällmittel der Frühgeburt und ist mit vielen der Morbiditäten der Frühreife verbunden, einschließlich nekrotisierender Enterokolitis (NEC). Eine mechanistische Verbindung zwischen diesen beiden Bedingungen muss jedoch noch entdeckt werden. Wir haben ein murines Modell der Chorioamnionitis mit Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte fetale Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung (FEMI) angenommen. Dieses Modell von FEMI induziert eine sterile mütterliche, Plazenta und fetale entzündliche Kaskade, die auch in vielen Fällen der klinischen Chorioamnionitis vorhanden ist. Obwohl Es Modelle gibt, die lebende Bakterien nutzen und die Pathophysiologie einer aufsteigenden Infektion, die zu Einer Chorioamnionitis führt, genauer imitieren, können diese Methoden indirekte Auswirkungen auf die Entwicklung des unreifen Darmtraktes und das damit verbundene entwickelnde Mikrobiom verursachen. Mit diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass LPS-induzierte FEMI zu einer dosisabhängigen Zunahme des Schwangerschaftsverlusts und der Frühgeburt sowie zu einer Störung der normalen Darmentwicklung bei Nachkommen führt. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass FEMI darmverletzungen und Serumzytokine bei Nachkommen signifikant erhöht und gleichzeitig Die Kelch- und Panethzellen verringert, die beide eine erste Reihe angeborener Immunität gegen Darmentzündungen bieten. Obwohl ein ähnliches Modell der LPS-induzierten FEMI verwendet wurde, um die Assoziation zwischen Chorioamnionitis und nachfolgenden Anomalien des zentralen Nervensystems zu modellieren, ist dieses Protokoll unseres Wissens der erste Versuch, eine mechanistische Verbindung zwischen Chorioamnionitis und späteren Störungen in der Darmentwicklung als potenzielleverbindung zwischen Chorioamnionitis und NEC aufzuklären.

Die Exposition gegenüber FEMI am embryonalen Tag 15 führt zu einem dosisabhängigen Schwangerschaftsverlust und einer dosisabhängigen Rate der Frühzeitarbeit (Abbildung 1)42. Für die Experimente haben wir uns für eine LPS-Dosis von 100 g/kg entschieden, um Schwangerschaftsverlust und Frühreife (50% Verlust zwischen Frühreife und intrauterinem fetalem Tod) zu minimieren und gleichzeitig die Föten einer signifikanten entzündlichen Beleidigung auszusetzen.
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A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Wir entwickelten ein Modell der Chorioamnionitis, um die fetale Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) ohne Komplikationen lebender Organismen zu simulieren, um die Auswirkungen von FEMI auf die Entwicklung des Darmtraktes der Nachkommen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Ursachen für die Entwicklung von Darmverletzungen nach Chorioamnionitis.

Ein murines Modell der fetalen Exposition gegenüber mütterlicher Entzündung, um die Auswirkungen der akuten Chorioamnionitis auf die Darmentwicklung von Neugeborenen zu untersuchen

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

3.7K Aufrufe.  University of Iowa. Wir entwickelten ein Modell der Chorioamnionitis, um die fetale Exposition gegenüber mütterlichen Entzündungen (FEMI) ohne Komplikationen lebender Organismen zu simulieren, um die Auswirkungen von FEMI auf die Entwicklung des Darmtraktes der Nachkommen zu untersuchen. Dies ermöglicht die Untersuchung der mechanistischen Ursachen für die Entwicklung von Darmverletzungen nach Chorioamnionitis.

Serie: A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Orthotopen Aorten-Transplantation: Ein Rattenmodell die Entwicklung von chronischen Vaskulopathie Study

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Forschung

Medizin

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Fetale Echokardiographie und Pulsed-Wave-Doppler-Ultraschall in einem Kaninchen-Modell von Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Murine Hornhauttransplantation: Ein Modell, das die häufigste Form der Organtransplantation Studieren

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

Ein Mausmodell der irreversiblen und reversiblen Einseitige Ureterobstruktion

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and bronchodilator drugs. Despite the availability of multiple treatments, both diseases are growing public health concerns. The majority of asthma patients are well controlled on current inhaled therapies but a substantial number of patients with severe asthma are not. Asthma affects an estimated 300 million people worldwide and approximately 20 percent have a severe form of the disease. In contrast to asthma, there are few effective therapies for COPD. An estimated 10% of the population has COPD and the trend in death rates is increasing for COPD while decreasing for other major diseases. Although developing drugs for inhaled delivery is challenging, the nose-only inhalation unit enables direct delivery of novel drugs to the lung of rodents for pre-clinical efficacy and safety/toxicology studies. Inhaled drug delivery has multiple advantages for respiratory diseases, where high concentration in the lung improves efficacy and minimizes systemic side effects. Inhaled corticosteroids and bronchodilators benefit from these advantages and inhaled delivery may also hold potential for future biologic therapies. The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs of rodents, key data required before initiating clinical development.

The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs; key data enabling clinical inhaled drug development.

Trockenpulver und Vernebelte Aerosol Inhalation von Arzneimitteln geliefert an Mäusen Mit einem Nose-only Belichtungssystem

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

Eine primäre menschlichen Trophoblast-Modell, die Wirkung der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Verordnung der Autophagie in der Plazenta zu studieren

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. Microbes have traditionally been classified based on their ability to use or tolerate oxygen. Supplemental oxygen is a common medical therapy administered to people with cystic fibrosis (pwCF); however, existing studies on oxygen and the airway microbiome have focused on how hypoxia (low oxygen) rather than hyperoxia (high oxygen) affects the predominantly aerobic and facultative anaerobic lung microbial communities. To address this critical knowledge gap, this protocol was developed using an artificial sputum medium that mimics the composition of sputum from pwCF. The use of filter sterilization, which yields a transparent medium, allows optical methods to follow the growth of single-celled microbes in suspension cultures. To create hyperoxic conditions, this model system takes advantage of established anaerobic culturing techniques to study hyperoxic conditions; instead of removing oxygen, oxygen is added to cultures by daily sparging of serum bottles with a mixture of compressed oxygen and air. Sputum from 50 pwCF underwent daily sparging for a 72-h period to verify the ability of this model to maintain differential oxygen conditions. Shotgun metagenomic sequencing was performed on cultured and uncultured sputum samples from 11 pwCF to verify the ability of this medium to support the growth of commensal and pathogenic microbes commonly found in cystic fibrosis sputum. Growth curves were obtained from 112 isolates obtained from pwCF to verify the ability of this artificial sputum medium to support the growth of common cystic fibrosis pathogens. We find that this model can culture a wide variety of pathogens and commensals in CF sputum, recovers a community highly similar to uncultured sputum under normoxic conditions, and creates different culture phenotypes under varying oxygen conditions. This new approach might lead to a better understanding of unanticipated effects induced by the use of oxygen in pwCF on airway microbial communities and common respiratory pathogens.

The goal of this protocol is to develop a model system for the effect of hyperoxia on cystic fibrosis airway microbial communities. Artificial sputum medium emulates the composition of sputum, and hyperoxic culture conditions model the effects of supplemental oxygen on lung microbial communities.

Design und Entwicklung eines Modells zur Untersuchung der Wirkung von zusätzlichem Sauerstoff auf das Mukoviszidose-Atemwegsmikrobiom

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Standardisierte Tuina-Manipulation bei Kniearthrose bei Ratten

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Autor im Rampenlicht: Verständnis des Mechanismus der Tuina-Manipulation bei Ratten 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Tuina-Manipulation zur Verringerung von Entzündung und Knorpelverlust bei Ratten mit Kniearthrose

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...