Este trabalho foi apoiado em parte através dos Institutos Nacionais de Saúde (DK097335 & T32AI007260) e do Departamento de Pediatria da Família Stead da Universidade de Iowa.

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Iowa (Protocol #8041401). Todos os animais foram alojados em uma Associação de Avaliação e Acreditação de Cuidados De Animais laboratoriais (AALAC) aprovada na Universidade de Iowa. Todos os ratos eram do tipo selvagem C57Bl/6J.
1. Estabelecimento de FEMI em camundongos gestantes
<ol><li>Preparação do LPS<ol>
<li>Use LPS derivado de Escherichia coli O55:B5 (concentração de estoque 2 mg/mL).</li>
		<li>Concentração de estoque de LPS diluída 1:100 com soro fisiológico estéril para uma concentração de trabalho de 20 μg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injeção de LPS materno<ol>
<li>Injete barragens grávidas no dia da gestação e15. Esse ponto de tempo é de aproximadamente 75% durante a gestação murina, tornando esse modelo de desenvolvimento semelhante ao terceiro trimestre precoce de gestações humanas, que é quando ocorre a maioria dos nascimentos prematuros devido à cooamnionite.</li>
		<li>Pese camundongos gestantes imediatamente antes da injeção para determinar a dosagem LPS apropriada.</li>
		<li>Calcule a dose de concentração de trabalho utilizando a seguinte fórmula: 5 μL x grama de peso corporal (gbw), para uma dose total de LPS de 100 μg/kg. Para animais de controle, use um volume equivalente de soro fisiológico normal para injeção.</li>
		<li>Solução LPS vortex três vezes por 15 segundos em alta antes de cada injeção.</li>
		<li>Desenhe o volume LPS em uma seringa de 1 mL.</li>
		<li>Contenha o rato grávida com técnica de escroffing. Segure na posição de recumbência dorsal e realize a injeção.<ol>
<li>Insira uma agulha de 30 mm de 8 mm sobreo painel do quadrante inferior direito do abdômen (para evitar bexiga e vasos abdominais) em um ângulo de 30\u201240°. Insira cerca de 1/4 a 1/2 o comprimento da agulha.</li>
			<li>Puxe para trás o êmbolo da seringa para garantir a pressão negativa antes da injeção. Proceda com a injeção se houver pressão negativa.</li>
			<li>Após a injeção, monitore os camundongos por aproximadamente 30 minutos e depois retorne às gaiolas pelo resto da gravidez.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Parto e cuidado de descendentes, e colheita intestinal
<ol><li>Entregue filhotes normalmente através do parto vaginal no e20. NOTA: Este modelo tem uma taxa de perda fetal dependente de dose esperada que pode ser observada na Figura 1 e é discutida nos resultados abaixo.</li>
	<li>Permita que os filhotes permaneçam com as mães e recebam rações ad libitum.</li>
	<li>No dia da colheita, tipicamente no dia 14 (P14), os filhotes de eutanásia via deslocamento cervical em conformidade com os protocolos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.</li>
	<li>Usando tesouras e fórceps, faça uma incisão vertical pela linha média do abdômen, através da pele e do peritônio, durante toda a extensão do abdômen. Extirpe o intestino delgado do estômago até o ceco com uma tesoura e remova a mesenteria com fórceps.</li>
	<li>Isole e mantenha o distal 1/3 do intestino delgado (seção representativa do íleo humano), descartando o intestino delgado proximal, o ceco e o cólon.</li>
	<li>Divida a porção de íleo ao meio usando uma tesoura.</li>
	<li>Coloque a metade proximal em uma solução de estabilização de RNA para quantificação posterior do RNA.</li>
	<li>Coloque a metade distal em formalina tamponada 10% neutra para a preparação do slide.</li>
</ol>3. Pontuação de lesão intestinal
<ol><li>Seção parafina embutida tecido em fatias de 5 μm de espessura e montar em lâminas de vidro. NOTA: Enviamos os espécimes para um núcleo de histologia para incorporação, secção e montagem em slides.</li>
	<li>Desparafinar slides de acordo com os procedimentos padrão.</li>
	<li>Manchas com hematoxilina e eosina de acordo com os procedimentos padrão.</li>
	<li>Escore seções em uma escala de 3 pontos para lesão intestinal como descrito anteriormente42,43.<ol>
<li>Utilizando microscopia leve, avalie a lesão intestinal generalizada por dois investigadores cegos separados em uma escala de 3 pontos avaliando a integridade e separação de Villus da membrana do porão43 (Figura Suplementar 1). A lesão intestinal é melhor avaliada em ampliação de 20x e abertura numérica 0,50.</li>
		<li>Atribua uma pontuação de 0 para descrever a mucosa normal.</li>
		<li>Atribuir uma pontuação de 1 descrever lesão leve que abrange o desenvolvimento do espaço subepiteliol gruenhagen, vacuolização ou elevação subepithelial limitada à lavímen propria ou pontas de villi.</li>
		<li>Atribua um escore de 2 para descrever lesões graves, indicadas por elevação epitelial e vacuolização maior que a metade da vílli, distorção de villi ou ulceração mucosa e desintegração da órcia de lamina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Quantificação de panése e células de cálice
<ol><li>Após a desparafinação, manchas deslizam de seções teciduais da Etapa 2.8 com a mancha de Ácido Azul/Periódico Alcian Schiff para denotar tanto as células de cálice quanto de Paneth como descrito anteriormente44,45 de acordo com as etapas a seguir. NOTA: Embora a mancha de Alcian Blue/Periodic Acid Schiff não seja específica nem para células paneth ou cálices, em nossa experiência, investigadores experientes cegos têm quantificação celular equivalente usando esta mancha em comparação com anticorpos mirados celulares, com significativamente menos coloração de fundo46.</li>
	<li>Desparafinar, manchar e desidratar lâminas da seguinte forma.<ol>
<li>Submergir desliza em xileno por 10 minutos duas vezes. ATENÇÃO: O xileno deve ser usado em um capô de fumaça.</li>
		<li>Enxágüe com 100% etoh.</li>
		<li>Submergir slides em 100 % EtOH por 3 min, depois em 90% EtOH por 3 min, seguido por 70% EtOH por 3 min, e por último submergir slides em 50% EtOH por 3 min.</li>
		<li>Lave sob água da torneira por 5 minutos. ATENÇÃO: Aponte a seção para longe da água corrente para evitar a perda da amostra de tecido.</li>
		<li>Filtrar a solução de mancha azul alciana com um filtro de café padrão.</li>
		<li>A mancha desliza na mancha azul alciana por 15 minutos e depois lava sob água da torneira por 2 minutos.</li>
		<li>Diluir 1 mg de ácido periódico em 200 mL de água dupla destilada. Submergir slides nesta solução por 5 minutos. Em seguida, lave sob água da torneira por 1 min.</li>
		<li>Mancha com o reagente de Schiff por 10 minutos. Lave sob água da torneira por 5 minutos.</li>
		<li>Manche os slides com hematoxilina por 1 min e depois lave sob água da torneira por 2 minutos.</li>
		<li>Submergir-os em álcool ácido (1 mL de ácido clorídrico misturado em 99 mL de 70% EtOH) por 1 min.</li>
		<li>Submergir na água da torneira de Scott (0,1% de concentração de NaHCO3 na água da torneira) por 1 min e depois lavar sob água da torneira por 1 min.</li>
		<li>Desidratar os slides.<ol>
<li>Mergulhe cada slide 10 vezes em 70% EtOH, depois diminua 10 vezes em 90% EtOH e 10 vezes em 100% EtOH.</li>
			<li>Submergir desliza em 100% EtOH por 10 minutos, seguido por submergir duas vezes em xileno fresco por 3 min cada.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque uma gota de mídia de montagem sobre o espécime e coloque uma mancha sobre ele.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contagem de células de cálice<ol>
<li>Utilizando microscopia leve, conte células de cálice(Figura Suplementar 2). Para cada pedaço de tecido intestinal, conte o número de células de cálice e 500 células epiteliais e expresse a razão das células de cálice como uma razão por 100 células epiteliais. As células cálices são melhor contadas em ampliação de 20x e abertura numérica 0,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Contagem de células de Paneth<ol>
<li>Utilizando microscopia leve, conte células paneth(Figura Suplementar 2). Para cada pedaço de tecido intestinal, expresse como uma razão de células paneth por cripta intestinal. Conte 100 criptas intestinais por cada pedaço de tecido intestinal. As células paneth são melhor contadas em 20x-60x de ampliação e abertura numérica 0,50-1,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A coioamnionite impacta 2\u20124% do prazo e 25\u201230% das entregas pré-termo8,9. No entanto, o impacto da coioamnionite pode se estender muito além do nascimento, pois tem se mostrado ter efeitos significativos sobre o feto e o recém-nascido10,11,12,13,14,15<sup...

As membranas coriônicas desempenham um papel integral na gravidez dos mamíferos. Eles incluem o acorde e amnion, que servem múltiplas funções. Cercam e protegem o feto, facilitam a sinalização paracrina entre os compartimentos materno e fetal1, e criam laços de feedback locais dentro das membranas coriônicas, que podem estar envolvidas no início da parturição1. A compreensão atual das membranas indica que o amnion fornece função de barreira estrutural, e o acorde fornece um tampão imunológico principalmente para proteger o feto em desenvolvimento do sistema imunológico materno2. A inflamação dessas membranas é conhecida como coioamnionite. Historicamente, o diagnóstico de coioamnionite clínica foi feito após a presença de febre materna mais um ou mais achados clínicos fetais ou maternos3,4. No entanto, embora essa definição seja clinicamente útil, sua falta de precisão tornou a pesquisa de coioamnionite desafiadora. Em 2015, na tentativa de esclarecer o diagnóstico, uma oficina de painéis de especialistas do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano Eunice Kennedy Shriver definiu a coioamnionite como inflamação intrauterina, ou infecção, ou ambos (triplo I)3. Esse esclarecimento é importante porque, embora a infecção induzida por microbiano seja uma importante causa de inflamação uterina/amniótica, ocorre menos comumente do que a inflamação uterina/amniótica estéril5,6,7. No geral, a coioamnionite continua sendo um problema significativo de saúde pública, como é visto em 2\u20124% dos partos a termo e 25\u201230% das entregas pré-termo8,9.
A coioamnionite pode ter efeitos significativos no feto e no recém-nascido. Tem sido bem documentado na literatura que a coioamnionite está associada ao aumento do risco de muitas das morbidades da prematuridade, incluindo displasia broncopulmonar10, lesão de matéria branca cerebral11,hemorragia intraventricular12, retinopatia da prematuridade13, e tanto suspeita e confirmada início precoce da sepse neonatal14,15. Como estamos interessados em mecanismos de lesão e reparação do trato intestinal imaturo, é importante notar que a coioamnionite também está associada ao desenvolvimento posterior da enterocolite necrosante (NEC)15,16. A NEC é uma doença gastrointestinal devastadora de bebês prematuros que resulta em uma resposta desregulada do hospedeiro à inflamação e necrose intestinal subsequente17. A cada ano, a NEC afeta mais de 4.000 bebês nos Estados Unidos, e até um terço desses bebês morrem pela doença18. A patogênese da NEC provavelmente envolve uma combinação de imaturidade intestinal, desregulação do sistema imunológico imaturo, inflamação intestinal e translocação bacteriana19,culminando em uma via comum final de necrose intestinal. É importante ressaltar que o início da NEC ocorre muitas vezes semanas após o nascimento e exposição potencial à coioamnionite, tornando incerto o vínculo mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento subsequente da NEC20. Um mecanismo potencial pelo qual a coioamnionite pode contribuir para a fisiopatologia da NEC é através da regulação do sistema imunológico materno, produzindo posteriormente uma forte resposta inflamatória fetal que pode interromper os padrões normais de desenvolvimento fetal21,22,23.
Múltiplos modelos mamíferos de coioamnionite existem em roedores e ovelhas24,25,26,27,28,29,30,31,32. No entanto, existem poucos dados relativos ao desenvolvimento do trato intestinal além do período inicial do recém-nascido após a exposição fetal induzida pela coioamnionite à inflamação materna (FEMI). A fim de explorar a relação entre FEMI e o desenvolvimento subsequente da lesão do trato intestinal imaturo, adaptamos o modelo FEMI induzido por lipopolissacarídeo (LPS). Lipopolisacarídeos são um componente importante da superfície extracelular em bactérias gram negativas e são um potente estimulante do sistema imunológico inato de múltiplas espécies eucarióticas, incluindo humanos33. A injeção de LPS materno resulta em uma cascata inflamatória estéril sem os efeitos confusos das bactérias vivas, sendo um modelo bem estabelecido para a indução do nascimento pré-parto34, bem como um modelo de corioamnionite aguda e a síndrome de resposta inflamatória fetal (FIRS), que é a forma mais grave de coioamnionite24,35. Também foi demonstrado induzir tanto a lesão de matéria branca e cinza cerebral em um modelo de ovelha36 como um modelo murino37,38,39,40. No entanto, pelo que sabemos, somos os primeiros a utilizar esse modelo de coioamnionite e FEMI para investigar seus efeitos no desenvolvimento do trato gastrointestinal após o nascimento, bem como para investigar uma possível ligação mecanicista entre a coioamnionite e o desenvolvimento posterior da NEC41,42.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>Newcomer supply</td>
			<td>1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin stain</td>
			<td>Leica</td>
			<td>381562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-U Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>2CE-MQVJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>H5106</td>
			<td>CAS# 10450-59-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Am7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#39;s reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secor Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Discovery (MSD)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Plex Assay</td>
			<td>Meso Scale Discovery (MSD)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of fetal exposure to maternal inflammation to study the effects of acute chorioamnionitis on newborn intestinal development

A coioamnionite é um precipitante comum do nascimento prematuro e está associada a muitas das morbidades da prematuridade, incluindo enterocolite necrosante (NEC). No entanto, ainda não foi descoberto um elo mecanicista entre essas duas condições. Adotamos um modelo murino de coioamnionite envolvendo lipopolisacarídeo (LPS) induzido exposição fetal à inflamação materna (FEMI). Este modelo de FEMI induz uma cascata inflamatória materna, placentária e fetal estéril, que também está presente em muitos casos de coioamnionite clínica. Embora existam modelos que utilizem bactérias vivas e imitem com mais precisão a fisiopatologia de uma infecção ascendente que resulta em coioamnionite, esses métodos podem causar efeitos indiretos no desenvolvimento do insorudo do trato intestinal imaturo e do microbioma em desenvolvimento associado. Usando este protocolo, demonstramos que o FEMI induzido pelo LPS resulta em um aumento dependente de dose na perda de gravidez e nascimento prematuro, bem como interrupção do desenvolvimento intestinal normal na prole. Além disso, demonstramos que o FEMI aumenta significativamente a lesão intestinal e citocinas séricas na prole, ao mesmo tempo em que diminui as células de cálice e Paneth, ambas fornecem uma primeira linha de imunidade inata contra inflamação intestinal. Embora um modelo semelhante de FEMI induzido pelo LPS tenha sido usado para modelar a associação entre corioamnionite e anormalidades subsequentes do sistema nervoso central, pelo que sabemos, este protocolo é o primeiro a tentar elucidar um elo mecanicista entre a coioamnionite e posterior perturbações no desenvolvimento intestinal como um potencial elo entre a coioamnionite e a NEC.

A exposição ao FEMI no dia 15 embrionário leva a uma perda dependente de dose da gravidez e uma taxa dependente de dose de trabalho de parto prematuro(Figura 1)42. Para os experimentos, optou-se por usar uma dose de LPS de 100 μg/kg para minimizar a perda e a prematuridade da gravidez (perda de 50% entre prematuridade e morte fetal intrauterina) enquanto expunimos os fetos a um insulto inflamatório significativo.
Usando esta abordagem,...

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A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

3.7K visualizações.  University of Iowa. Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

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Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Transplante ortotópico de aorta: um modelo de rato para estudar o desenvolvimento de vasculopatia crônica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Medicina

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Avaliar as alterações teratogênicos em um modelo de Zebrafish de exposição fetal ao álcool

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Ecocardiografia fetal e ultra-som Doppler pulsátil em um modelo de coelho de restrição do crescimento intra-uterino

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Murino transplante de córnea: Um modelo para estudar a forma mais comum de Transplante de Órgãos Sólidos

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

Um modelo murino de irreversível e reversível obstrução ureteral unilateral

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and bronchodilator drugs. Despite the availability of multiple treatments, both diseases are growing public health concerns. The majority of asthma patients are well controlled on current inhaled therapies but a substantial number of patients with severe asthma are not. Asthma affects an estimated 300 million people worldwide and approximately 20 percent have a severe form of the disease. In contrast to asthma, there are few effective therapies for COPD. An estimated 10% of the population has COPD and the trend in death rates is increasing for COPD while decreasing for other major diseases. Although developing drugs for inhaled delivery is challenging, the nose-only inhalation unit enables direct delivery of novel drugs to the lung of rodents for pre-clinical efficacy and safety/toxicology studies. Inhaled drug delivery has multiple advantages for respiratory diseases, where high concentration in the lung improves efficacy and minimizes systemic side effects. Inhaled corticosteroids and bronchodilators benefit from these advantages and inhaled delivery may also hold potential for future biologic therapies. The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs of rodents, key data required before initiating clinical development.

The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs; key data enabling clinical inhaled drug development.

Pó seco e nebulizada de inalação de aerossóis de produtos farmacêuticos entregue no Ratos Usando um nariz somente Sistema de Exposição

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

Um modelo de trofoblasto humano primário para estudar o efeito da inflamação associada com obesidade materna no Regulamento de autofagia na Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. Microbes have traditionally been classified based on their ability to use or tolerate oxygen. Supplemental oxygen is a common medical therapy administered to people with cystic fibrosis (pwCF); however, existing studies on oxygen and the airway microbiome have focused on how hypoxia (low oxygen) rather than hyperoxia (high oxygen) affects the predominantly aerobic and facultative anaerobic lung microbial communities. To address this critical knowledge gap, this protocol was developed using an artificial sputum medium that mimics the composition of sputum from pwCF. The use of filter sterilization, which yields a transparent medium, allows optical methods to follow the growth of single-celled microbes in suspension cultures. To create hyperoxic conditions, this model system takes advantage of established anaerobic culturing techniques to study hyperoxic conditions; instead of removing oxygen, oxygen is added to cultures by daily sparging of serum bottles with a mixture of compressed oxygen and air. Sputum from 50 pwCF underwent daily sparging for a 72-h period to verify the ability of this model to maintain differential oxygen conditions. Shotgun metagenomic sequencing was performed on cultured and uncultured sputum samples from 11 pwCF to verify the ability of this medium to support the growth of commensal and pathogenic microbes commonly found in cystic fibrosis sputum. Growth curves were obtained from 112 isolates obtained from pwCF to verify the ability of this artificial sputum medium to support the growth of common cystic fibrosis pathogens. We find that this model can culture a wide variety of pathogens and commensals in CF sputum, recovers a community highly similar to uncultured sputum under normoxic conditions, and creates different culture phenotypes under varying oxygen conditions. This new approach might lead to a better understanding of unanticipated effects induced by the use of oxygen in pwCF on airway microbial communities and common respiratory pathogens.

The goal of this protocol is to develop a model system for the effect of hyperoxia on cystic fibrosis airway microbial communities. Artificial sputum medium emulates the composition of sputum, and hyperoxic culture conditions model the effects of supplemental oxygen on lung microbial communities.

Projeto e Desenvolvimento de um Modelo para Estudar o Efeito do Oxigênio Suplementar no Microbioma da Fibrose Cística

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Manipulação padronizada de Tuina para osteoartrite do joelho em ratos

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Autor em destaque: Compreendendo o mecanismo de manipulação da tuina em ratos 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Manipulação de Tuina para Reduzir a Inflamação e Perda de Cartilagem em Ratos com Osteoartrite de Joelho

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...