Este trabajo fue apoyado en parte a través de los Institutos Nacionales de Salud (DK097335 & T32AI007260) y el Departamento de Pediatría de la Familia Stead de la Universidad de Iowa.

Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Iowa (Protocolo #8041401). Todos los animales fueron alojados en un vivarium aprobado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AALAC) en la Universidad de Iowa. Todos los ratones eran cepa de tipo salvaje C57Bl/6J.
1. Establecimiento de FEMI en ratones embarazadas
<ol><li>Preparación lps<ol>
<li>Utilice LPS derivado de Escherichia coli O55:B5 (concentración de stock 2 mg/ml).</li>
		<li>Diluir la concentración de existencias lps 1:100 con solución salina estéril para una concentración de trabajo de 20 μg/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyección materna de LPS<ol>
<li>Inyecte presas embarazadas en el día de gestación e15. Este punto de tiempo es aproximadamente el 75% a través del embarazo murino, por lo que este modelo es similar al tercer trimestre temprano de los embarazos humanos, que es cuando se producen la mayoría de los partos prematuros debido a la colemonionitis.</li>
		<li>Pesar ratones embarazadas inmediatamente antes de la inyección para determinar la dosificación adecuada de LPS.</li>
		<li>Calcular la dosis de concentración de trabajo utilizando la siguiente fórmula: 5 μL x gramo de peso corporal (gbw), para una dosis total de LPS de 100 μg/kg. Para animales de control, utilice un volumen equivalente de solución salina normal para inyección.</li>
		<li>Solución Vortex LPS tres veces durante 15 segundos en alto antes de cada inyección.</li>
		<li>Dibuja el volumen LPS en una jeringa de 1 ml.</li>
		<li>Frene al ratón embarazada con una técnica de desaliñada. Sujete en posición de recumbencia dorsal y realice la inyección.<ol>
<li>Inserte una aguja de 30 calibres y 8 mm biselado sobre el cuadrante inferior derecho del abdomen (para evitar la vejiga y los vasos abdominales) en un ángulo de 30\u201240°. Inserte aproximadamente 1/4 a 1/2 la longitud de la aguja.</li>
			<li>Tire hacia atrás en el émbolo de la jeringa para asegurar la presión negativa antes de la inyección. Proceda con la inyección si hay presión negativa.</li>
			<li>Después de la inyección, monitoree ratones durante aproximadamente 30 minutos y luego regrese a jaulas durante el resto del embarazo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Parto y cuidado de la descendencia, y la cosecha intestinal
<ol><li>Entregue cachorros normalmente a través del parto vaginal en e20. NOTA: Este modelo tiene una tasa de pérdida fetal dependiente de la dosis esperada que se puede ver en la Figura 1 y se discute en los resultados a continuación.</li>
	<li>Permita que los cachorros permanezcan con las madres y reciban alimentos ad libitum.</li>
	<li>El día de la cosecha, típicamente el día postnatal 14 (P14), eutanasia a los cachorros a través de la dislocación cervical en cumplimiento de los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.</li>
	<li>Usando tijeras y fórceps, hacer una incisión vertical por la línea media del abdomen, a través de la piel y el peritoneo, durante toda la longitud del abdomen. Excitar el intestino delgado desde el estómago hasta el cecum con tijeras y eliminar el mesenterio con fórceps.</li>
	<li>Aísle y mantenga el distatal 1/3 del intestino delgado (sección representativa del íleo humano), descartando el intestino delgado proximal, el cecum y el colon.</li>
	<li>Divida la porción de ileum por la mitad con tijeras.</li>
	<li>Coloque la mitad proximal en una solución de estabilización de ARN para una cuantificación posterior del ARN.</li>
	<li>Coloque la mitad distal en formalina en búfer neutral al 10% para la preparación de diapositivas.</li>
</ol>3. Puntuación de lesiones intestinales
<ol><li>Sección de tejido incrustado de parafina en rodajas de 5 μm de espesor y montaje en toboganes de vidrio. NOTA: Enviamos las muestras a un núcleo histología para la incrustación, sección y montaje de parafinas en diapositivas.</li>
	<li>Deparafinar diapositivas de acuerdo con los procedimientos estándar.</li>
	<li>Mancha secciones con hematooxilina y eosina de acuerdo con los procedimientos estándar.</li>
	<li>Puntúe secciones en una escala de 3 puntos para lesiones intestinales como se describió anteriormente42,43.<ol>
<li>Utilizando microscopía ligera, evalúe la lesión intestinal generalizada por dos investigadores ciegos separados en una escala de 3 puntos que evalúa la integridad del vello y la separación de la membrana del sótano43 (Figura suplementaria 1). La lesión intestinal se evalúa mejor con una ampliación de 20x y una apertura numérica 0,50.</li>
		<li>Asigne una puntuación de 0 para describir la mucosa normal.</li>
		<li>Asignar una puntuación de 1 describir lesiones leves que abarca el desarrollo del espacio de Gruenhagen subepithelial, vacuolización o elevación subepithelial limitada a la propria lamina o puntas de villi.</li>
		<li>Asignar una puntuación de 2 para describir lesiones graves, indicadas por elevación epitelial y vacuolización mayor a la mitad de la villi, distorsión vil, o ulceración mucosa y desintegración de la propria lamina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cuantificación de las células de paneth y copas
<ol><li>Después de la deparafinación, las manchas se deslizan de secciones de tejido del Paso 2.8 con mancha alcian Blue/Periodic Acid Schiff para denotar tanto las células de copa como las de Paneth como se describió anteriormente44,45 de acuerdo con los siguientes pasos. NOTA: Mientras que la mancha alcian azul/ácido periódico Schiff no es específica ni para las células de Paneth o de la copa, en nuestra experiencia, los investigadores experimentados cegados tienen cuantificación celular equivalente utilizando esta mancha en comparación con los anticuerpos dirigidos a celulares, con significativamente menos mancha de fondo46.</li>
	<li>Deparafinar, manchar y deshidratar diapositivas de la siguiente manera.<ol>
<li>Sumerja las diapositivas en xileno durante 10 minutos dos veces. PRECAUCIÓN: El xileno debe utilizarse en una campana de humo.</li>
		<li>Enjuague con etoh 100%.</li>
		<li>Sumerge las diapositivas en 100 % EtOH durante 3 min, luego en 90% EtOH durante 3 min, seguido por 70% EtOH durante 3 min, y por último sumergir diapositivas en 50% EtOH durante 3 min.</li>
		<li>Lave bajo agua corriente del grifo durante 5 minutos. PRECAUCIÓN: Apunte la sección lejos del agua corriente para evitar la pérdida de muestras de tejido.</li>
		<li>Filtre la solución de mancha azul alcian con un filtro de café estándar.</li>
		<li>Manchas en manchas azules alcian durante 15 minutos y luego lavar bajo agua corriente del grifo durante 2 minutos.</li>
		<li>Diluir 1 mg de ácido periódico en 200 ml de agua destilada doble. Sumerja las diapositivas en esta solución durante 5 min. A continuación, lave bajo agua corriente del grifo durante 1 minuto.</li>
		<li>Mancha con el reactivo de Schiff durante 10 minutos. Lave bajo agua corriente del grifo durante 5 minutos.</li>
		<li>Mancha los toboganes con hematoxilina durante 1 minuto y luego lave bajo agua corriente del grifo durante 2 minutos.</li>
		<li>Sumergirlos en alcohol ácido (1 ml de ácido clorhico mezclado en 99 ml de 70% EtOH) durante 1 min.</li>
		<li>Sumérgete en el agua del grifo de Scott (0,1% de concentración de NaHCO3 en agua del grifo) durante 1 min y luego lave bajo agua corriente del grifo durante 1 min.</li>
		<li>Deshidratar las diapositivas.<ol>
<li>Sumerja cada diapositiva 10 veces en 70% EtOH, luego sumerja 10 veces en 90% EtOH, y 10 veces en 100% EtOH.</li>
			<li>Sumerge los toboganes en 100% EtOH durante 10 minutos, seguido de sumergirse dos veces en xileno fresco durante 3 minutos cada uno.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coloque una gota de soporte de montaje en la muestra y coloque una cubierta sobre ella.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuento de células de copas<ol>
<li>Usando microscopía ligera, cuente las células de la copa(Figura Suplementaria 2). Para cada pieza de tejido intestinal, cuente el número de células de copa y 500 células epiteliales y la proporción de células de copa expresa como una proporción por cada 100 células epiteliales. Las células de copa se cuentan mejor con una ampliación de 20x y una apertura numérica 0,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recuento de celdas paneth<ol>
<li>Usando microscopía ligera, cuente las células de Paneth(Figura Suplementaria 2). Para cada pieza de tejido intestinal, expresar como una proporción de las células de Paneth por cripta intestinal. Contar 100 criptas intestinales por cada pieza de tejido intestinal. Las celdas paneth se cuentan mejor con una ampliación de 20x-60x y una apertura numérica 0,50-1,30.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La colemonionitis afecta al 2\u20124% del plazo y al 25\u201230% de los partos prematuros8,9. Sin embargo, el impacto de la coleamnionitis puede extenderse mucho más allá del nacimiento, ya que se ha demostrado que tiene efectos significativos en el feto y neonato10,11,12,13,14,<sup class=...

Las membranas corionicas desempeñan un papel integral en el embarazo de mamíferos. Incluyen el coro y la amnion, que cumplen múltiples funciones. Rodean y protegen el feto, facilitan la señalización paracrina entre los compartimentos materno-fetal1y crean bucles de retroalimentación locales dentro de las membranas corionicas, que pueden estar involucrados en el inicio de la parturición1. La comprensión actual de las membranas indica que la amnion proporciona una función de barrera estructural, y la coral proporciona un amortiguador inmunológico principalmente para proteger al feto en desarrollo del sistema inmunitario materno2. Inflamación de estas membranas se conoce como colemonionitis. Históricamente, el diagnóstico de colemonionitis clínica se realizó a raíz de la presencia de fiebre materna más uno o más hallazgos clínicos fetales o maternos3,4. Sin embargo, si bien esta definición es clínicamente útil, su falta de precisión ha hecho que la investigación de la colemonionitis sea un desafío. En 2015, en un intento de aclarar el diagnóstico, un taller de panel de expertos del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver definió la colemonionitis como inflamación intrauterina, o infección, o ambas (triple I)3. Esta aclaración es importante porque si bien la infección inducida por microbianos es una causa importante de inflamación uterina/amniótica, ocurre con menos frecuencia que la inflamación estéril uterina/amniótica5,6,7. En general, la colemonionitis sigue siendo un problema importante de salud pública, como se observa en 2\u20124% de los partos a término y 25\u201230% de los partos prematuros8,9.
La colemonionitis puede tener efectos significativos en el feto y el neonato. En la literatura se ha documentado bien que la colemonionitis está asociada con un mayor riesgo de muchas de las morbilidades de la prematuridad, incluyendo displasia broncopulmonar10,lesión de materia blanca cerebral11,hemorragia intraventricular12,retinopatía de prematuridad13,y sepsis neonatal de inicio temprano sospechosa y confirmada14,15. Como estamos interesados en los mecanismos de lesiones y reparación del tracto intestinal inmaduro, es importante tener en cuenta que la colemonionitis también se asocia con el desarrollo posterior de enterocolitis necrosante (NEC)15,16. Nec es una enfermedad gastrointestinal devastadora de los bebés prematuros que resulta en una respuesta disregulada del huésped a la inflamación y la necrosis intestinal posterior17. Cada año, nec afecta a más de 4000 bebés en los Estados Unidos, y hasta un tercio de estos bebés mueren a causa de la enfermedad18. La patogénesis de NEC probablemente implica una combinación de inmadurez intestinal, desregulación del sistema inmunitario inmaduro, inflamación intestinal y translocación bacteriana19,que culmina en una vía común final de necrosis intestinal. Es importante destacar que la aparición de NEC a menudo ocurre semanas después del nacimiento y la exposición potencial a la colemonionitis, haciendo que el vínculo mecanicista entre la colaamnionitis y el desarrollo posterior de NEC no esté claro20. Un mecanismo potencial por el cual la colemonionitis puede contribuir a la fisiopatología de nec es a través de la regulación del sistema inmune materno, produciendo posteriormente una fuerte respuesta inflamatoria fetal que puede interrumpir los patrones normales de desarrollo fetal21,22,23.
Existen múltiples modelos de corioamnionitis en roedores y ovejas24,25,26,27,28,29,30,31,32. Sin embargo, existen pocos datos sobre el desarrollo del tracto intestinal más allá del período inicial del recién nacido después de la exposición fetal inducida por corioamnionitis a la inflamación materna (FEMI). Con el fin de explorar la relación entre FEMI y el posterior desarrollo de lesiones del tracto intestinal inmaduro, hemos adaptado el modelo FEMI inducido por lipopolisacáridos (LPS). Los lipopolisacáridos son un componente importante de la superficie extracelular sobre bacterias gram negativas y son un potente estimulante del sistema inmune innato de múltiples especies eucariotas, incluidos los seres humanos33. La inyección de LPS materno da como resultado una cascada inflamatoria estéril sin los efectos confusos de las bacterias vivas, y es un modelo bien establecido para la inducción del nacimiento prematuro34,así como un modelo de colemonionitis aguda y el síndrome de respuesta inflamatoria fetal (FIRS), que es la forma más grave de colemonionitis24,35. También se ha demostrado que induce lesiones cerebrales de materia blanca y gris en una oveja modelo36 y una murina modelo37,38,39,40. Sin embargo, hasta donde sabemos, somos los primeros en utilizar este modelo de coleamnionitis y FEMI para investigar sus efectos en el desarrollo del tracto gastrointestinal más allá del nacimiento, así como para investigar un posible vínculo mecanicista entre la coleamnionitis y el desarrollo posterior de NEC41,42.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>Newcomer supply</td>
			<td>1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl6/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin stain</td>
			<td>Leica</td>
			<td>381562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ni-U Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>2CE-MQVJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic Acid</td>
			<td>ACROS</td>
			<td>H5106</td>
			<td>CAS# 10450-59-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>Am7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#39;s reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secor Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Discovery (MSD)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Plex Assay</td>
			<td>Meso Scale Discovery (MSD)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>534056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a murine model of fetal exposure to maternal inflammation to study the effects of acute chorioamnionitis on newborn intestinal development

La colemonionitis es un precipitante común del parto prematuro y se asocia con muchas de las morbilidades de la prematuridad, incluida la enterocolitis necrosante (NEC). Sin embargo, aún no se ha descubierto un vínculo mecanicista entre estas dos condiciones. Hemos adoptado un modelo murino de colemonionitis que implica lipopolisacáridos (LPS) de exposición fetal inducida a la inflamación materna (FEMI). Este modelo de FEMI induce una cascada inflamatoria materna, placentaria y fetal estéril, que también está presente en muchos casos de colemonionitis clínica. Aunque existen modelos que utilizan bacterias vivas e imitan con mayor precisión la fisiopatología de una infección ascendente que resulta en corioamnionitis, estos métodos pueden causar efectos indirectos en el desarrollo del tracto intestinal inmaduro y el microbioma en desarrollo asociado. Utilizando este protocolo, hemos demostrado que el FEMI inducido por LPS resulta en un aumento dependiente de la dosis en la pérdida del embarazo y el parto prematuro, así como la interrupción del desarrollo intestinal normal en la descendencia. Además, hemos demostrado que el FEMI aumenta significativamente las lesiones intestinales y las citoquinas séricas en la descendencia, al tiempo que disminuyen las células de copa y paneth, que proporcionan una primera línea de inmunidad innata contra la inflamación intestinal. Aunque se ha utilizado un modelo similar de FEMI inducido por LPS para modelar la asociación entre la coleamnionitis y las anomalías posteriores del sistema nervioso central, hasta donde sabemos, este protocolo es el primero en intentar dilucidar un vínculo mecanicista entre la coleamnionitis y perturbaciones posteriores en el desarrollo intestinal como posible vínculo entre la corioamnionitis y el NEC.

La exposición al FEMI el día embrionario 15 conduce a una pérdida de embarazo dependiente de la dosis y a una tasa de dosis dependiente del trabajo de parto prematuro (Figura 1)42. Para los experimentos, elegimos utilizar una dosis de LPS de 100 μg/kg para minimizar la pérdida del embarazo y la prematuridad (50% de pérdida entre la prematuridad y la muerte fetal intrauterina) mientras exponía a los fetos a un insulto inflamatorio significativo.
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A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Desarrollamos un modelo de coleamnionitis para simular la exposición fetal a la inflamación materna (FEMI) sin complicaciones de organismos vivos para examinar los efectos del FEMI en el desarrollo del tracto intestinal de la descendencia. Esto permite el estudio de causas mecanicistas para el desarrollo de lesiones intestinales después de la coleamnionitis.

Un modelo murino de exposición fetal a la inflamación materna para estudiar los efectos de la coleamnionitis aguda en el desarrollo intestinal neonatal

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

3.7K vistas.  University of Iowa. Desarrollamos un modelo de coleamnionitis para simular la exposición fetal a la inflamación materna (FEMI) sin complicaciones de organismos vivos para examinar los efectos del FEMI en el desarrollo del tracto intestinal de la descendencia. Esto permite el estudio de causas mecanicistas para el desarrollo de lesiones intestinales después de la coleamnionitis.

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Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Trasplante ortotópico aórtica: un modelo de rata para estudiar el desarrollo de la enfermedad vascular crónica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Investigación

Medicina

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Evaluación de los cambios teratogénicos en un modelo de pez cebra de la exposición fetal al alcohol

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

Ecocardiografía Fetal y Ecografía Doppler de onda pulsada en un modelo de conejo de Restricción del crecimiento intrauterino

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each year. While several animal models exist for this procedure and mice are the species that is most commonly used. The reasons for using mice are the relative cost of using this species, the existence of many genetically defined strains that allow for the study of immune responses, and the existence of an extensive array of reagents that can be used to further define responses in this species. This model has been used to define factors in the cornea that are responsible for the relative immune privilege status of this tissue that enables corneal allografts to survive acute rejection in the absence of immunosuppressive therapy. It has also been used to define those factors that are most important in rejection of such allografts. Consequently, much of what we know concerning mechanisms of both corneal allograft acceptance and rejection are due to studies using a murine model of corneal transplantation. In addition to describing a model for acute corneal allograft rejection, we also present for the first time a model of late-term corneal allograft rejection.

Mice have been used as a model for studying many forms of transplantation, including corneal transplantation. We describe in this report a murine model for both acute and late-term corneal transplantation.

Murino Trasplante corneal: un modelo para estudiar la forma más común de trasplante de órganos sólidos

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

A Murine Model of Irreversible and Reversible Unilateral Ureteric Obstruction

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive nephropathy induced by unilateral ureteric obstruction (UUO), which can either be irreversible (UUO) or reversible (R-UUO). In the irreversible UUO model, the ureter may be obstructed for variable periods of time in order to induce increasingly severe renal inflammation and interstitial fibrotic scarring. In the reversible R-UUO model the ureter is obstructed to induce hydronephrosis, tubular dilation and inflammation. After a suitable period of time the ureteric obstruction is then surgically reversed by anastomosis of the severed previously obstructed ureter to the bladder in order to allow complete decompression of the kidney and restoration of urinary flow to the bladder. The irreversible UUO model has been used to investigate various aspects of renal inflammation and scarring including the pathogenesis of disease and the testing of potential anti-inflammatory or anti-fibrotic therapies. The more challenging model of R-UUO has been used by some investigators and does offer significant research potential as it allows the study of inflammatory and immune processes and tissue remodeling in an injured and scarred kidney following the removal of the injurious stimulus. As a result, the R-UUO model offers investigators the opportunity to explore the resolution of kidney inflammation together with key aspects of tissue repair. These experimental models are of relevance to human disease as patients often present with obstruction of the renal tract that requires decompression and are commonly left with significant residual kidney impairment that has no current treatment options and may lead to eventual end stage kidney failure.

The murine model of irreversible unilateral ureteric obstruction (UUO) is presented together with the model of reversible UUO in which the ureteric obstruction is relieved by anastomosis of the severed ureter into the bladder. These models enable the study of renal inflammation and scarring as well as tissue remodeling.

Un modelo murino de irreversible y reversible obstrucción ureteral unilateral

Obstruction of the kidney may affect native or transplanted kidneys and results in kidney injury and scarring. Presented here is a model of obstructive ...

Dry Powder and Nebulized Aerosol Inhalation of Pharmaceuticals Delivered to Mice Using a Nose-only Exposure System

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and bronchodilator drugs. Despite the availability of multiple treatments, both diseases are growing public health concerns. The majority of asthma patients are well controlled on current inhaled therapies but a substantial number of patients with severe asthma are not. Asthma affects an estimated 300 million people worldwide and approximately 20 percent have a severe form of the disease. In contrast to asthma, there are few effective therapies for COPD. An estimated 10% of the population has COPD and the trend in death rates is increasing for COPD while decreasing for other major diseases. Although developing drugs for inhaled delivery is challenging, the nose-only inhalation unit enables direct delivery of novel drugs to the lung of rodents for pre-clinical efficacy and safety/toxicology studies. Inhaled drug delivery has multiple advantages for respiratory diseases, where high concentration in the lung improves efficacy and minimizes systemic side effects. Inhaled corticosteroids and bronchodilators benefit from these advantages and inhaled delivery may also hold potential for future biologic therapies. The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs of rodents, key data required before initiating clinical development.

The inhalation unit described herein can generate, sample for characterization, and uniformly deposit a drug aerosol in the lungs of rodents. This enables the pre-clinical determination of the efficacy and safety of drug doses deposited in the lungs; key data enabling clinical inhaled drug development.

De polvo seco y nebulizada de inhalación de aerosol de productos farmacéuticos entregado a ratones utilizando un sólo Nose sistema de exposición

Obstructive respiratory diseases like asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are currently treated by inhaled anti-inflammatory and ...

A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be attributed to, in part, the dysregulation of autophagy. Aberrant changes in the expression of autophagy regulators in the placentas from obese pregnancies may be regulated by inflammatory processes associated with both obesity and pregnancy. Described here is a protocol for sampling of villous tissue and isolation of villous cytotrophoblasts from the term human placenta for primary cell culture. This is followed by a method for simulating the inflammatory milieu in the obese intrauterine environment by treating primary trophoblasts from lean pregnancies with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;), a proinflammatory cytokine that is elevated in obesity and in pregnancy. Through the implementation of the protocol described here, it is found that exposure to exogenous TNF&#945; regulates the expression of Rubicon, a negative regulator of autophagy, in trophoblasts from lean pregnancies with female fetuses. While a variety of biological factors in the obese intrauterine environment maintain the potential to modulate critical pathways in trophoblasts, this ex vivo system is especially useful for determining if expression patterns observed in vivo in human placentas with maternal obesity are a direct result of TNF&#945; signaling. Ultimately, this approach affords the opportunity to parse out the regulatory and molecular implications of inflammation associated with maternal obesity on autophagy and other critical cellular pathways in trophoblasts that have the potential to impact placental function.

Presented here is a protocol for sampling of human placental villous tissue followed by isolation of cytotrophoblasts for primary cell culture. Treatment of trophoblasts with TNF&#945; recapitulates inflammation in the obese intrauterine environment and facilitates the discovery of molecular targets regulated by inflammation in placentas with maternal obesity.

Un modelo de trofoblasto humano primario para estudiar el efecto de la inflamación asociado con obesidad materna sobre la regulación de la autofagia en la Placenta

Maternal obesity is associated with an increased risk of adverse perinatal outcomes that are likely mediated by compromised placental function that can be ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Medición de la contractilidad isométrica de la arteria mesentérica de ratón con cable miografía

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Design and Development of a Model to Study the Effect of Supplemental Oxygen on the Cystic Fibrosis Airway Microbiome

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. Microbes have traditionally been classified based on their ability to use or tolerate oxygen. Supplemental oxygen is a common medical therapy administered to people with cystic fibrosis (pwCF); however, existing studies on oxygen and the airway microbiome have focused on how hypoxia (low oxygen) rather than hyperoxia (high oxygen) affects the predominantly aerobic and facultative anaerobic lung microbial communities. To address this critical knowledge gap, this protocol was developed using an artificial sputum medium that mimics the composition of sputum from pwCF. The use of filter sterilization, which yields a transparent medium, allows optical methods to follow the growth of single-celled microbes in suspension cultures. To create hyperoxic conditions, this model system takes advantage of established anaerobic culturing techniques to study hyperoxic conditions; instead of removing oxygen, oxygen is added to cultures by daily sparging of serum bottles with a mixture of compressed oxygen and air. Sputum from 50 pwCF underwent daily sparging for a 72-h period to verify the ability of this model to maintain differential oxygen conditions. Shotgun metagenomic sequencing was performed on cultured and uncultured sputum samples from 11 pwCF to verify the ability of this medium to support the growth of commensal and pathogenic microbes commonly found in cystic fibrosis sputum. Growth curves were obtained from 112 isolates obtained from pwCF to verify the ability of this artificial sputum medium to support the growth of common cystic fibrosis pathogens. We find that this model can culture a wide variety of pathogens and commensals in CF sputum, recovers a community highly similar to uncultured sputum under normoxic conditions, and creates different culture phenotypes under varying oxygen conditions. This new approach might lead to a better understanding of unanticipated effects induced by the use of oxygen in pwCF on airway microbial communities and common respiratory pathogens.

The goal of this protocol is to develop a model system for the effect of hyperoxia on cystic fibrosis airway microbial communities. Artificial sputum medium emulates the composition of sputum, and hyperoxic culture conditions model the effects of supplemental oxygen on lung microbial communities.

Diseño y desarrollo de un modelo para estudiar el efecto del oxígeno suplementario en el microbioma de las vías respiratorias de la fibrosis quística

Airway microbial communities are thought to play an important role in the progression of cystic fibrosis (CF) and other chronic pulmonary diseases. ...

Manipulación estandarizada de Tuina para la artrosis de rodilla en ratas

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Autor destacado: Entendiendo el mecanismo de la manipulación de la tuina en ratas 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Manipulación de Tuina para reducir la inflamación y la pérdida de cartílago en ratas con artrosis de rodilla

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...