Diese Arbeit wurde von Innovative Junge Biotechnologist Auszeichnung BT/BI/12/040/2005 und BT/PR13289/BRB/10/745/2009 Zuschuss von Department für Biotechnologie, Regierung von Indien und Kernfonds, des Zentrums für DNA-Fingerprinting and Diagnostics unterstützt werden, Hyderabad. MNR und GB sind die Empfänger von Junior und Senior Research Fellowships des Rates für Wissenschaftliche und Industrielle Forschung auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University. SB ist der Empfänger von Junior und Senior Research Fellowship des Department für Biotechnologie auf die Verfolgung einer Doktorgrad der Manipal University.

Es wird empfohlen, C auszuführen glabrata Infektionsversuche im Labor mit Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2). <ol><li> Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monoschicht. </li><li> Vorbereitung von C. glabrata Zellsuspension. </li><li> Infektion von THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata-Zellen. </li><li> Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über koloniebildende Einheit-Assay. </li><li> Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. </li></ol> 1. Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monolayer <ol><li> THP-1 ist eine menschliche Monozyten-Zelllinie aus dem peripheren Blut eines 1-jährigen männlichen Kind leidet unter akuter Monozytenleukämie 14 abgeleitet. THP-1-Zelllinie wurde eine Suspension, wird routinemäßig bei 37 ° C in befeuchteter 5% CO 2 in RPMI-1640-Kulturmedium mit 10% FBS (fötales Rinderserum) ergänzt gehalten. Die Behandlung mit Phorbol 12-myristate 13-Acetat (PMA, ein Phorbolester) führt die terminale Differenzierung von THP-1 Monozyten zu Makrophagen. Wichtig ist, dass PMA-Behandlung keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen und differenzierten Zellen nicht teilen. </li><li> Samen ungefähr 1,5 x 10 6 THP-1 Monozyten in 100 mm Kulturschalen in RPMI-1640-Vollmedium (RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% Serum, 2 mM Glutamin und Antibiotika 1x; 10 ml / Schale) und lassen Zellen wachsen bei 37 ° C in 5% CO 2 für 2 Tage. </li><li> Sobald THP-1-Zellen haben eine Dichte von 8 x 10 5 Zellen / ml erreicht, übertragen Sie die Kulturschale zu der Zellkultur Laminarströmungshaube und schwenken Sie es ständiger Zellen resuspendieren. </li><li> Pipettieren Sie die Zellsuspension aus, legen Sie in eine 15 ml sterilen Röhrchen und Zentrifuge bei 1000 rpm (130 xg) für 4 min. Überstand verwerfen und aussetzen THP-1-Zellpellet in 5 ml frisches, vorgewärmt, RPMI-1640-Komplettmedium. </li><li> Auflisten von Zellen mit einer Zählkammer und verdünnt das cell Suspension auf eine endgültige Dichte von 10 6 Zellen / ml mit vorgewärmten RPMI 1640 Komplettmedium </li><li> 1 ul von 160 mM PMA Lager (Phorbol-12-Myristate 13-Acetat-Lösung in Dimethylsulfoxid hergestellt) in 10 ml THP-1-Zellsuspension (Endkonzentration 16 nM) und gut mischen. Verzichten 1 ml Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 12 h gehalten. </li><li> Entfernen Sie alte Medium, 1 ml vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen für 12 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2 zu erholen. </li><li> Beachten Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop zu gewährleisten, dass ovale THP-1 Monozyten-Zellen in Suspension wurden in abgeflacht spindelförmige und haftende Makrophagen differenziert. Diese differenzierten Zellen sind nun bereit, C führen glabrata Infektionsstudien. </li></ol> 2. Vorbereitung von C. glabrata &amp; #160; Zellsuspension C. glabrata Wildtyp-Stamm Bg2 werden zur THP-1-Makrophagen infizieren werden. C glabrata Zellen in flüssigem YPD (Hefeextrakt (1%), Pepton (2%)-Dextrose (2%)) Medium routinemßig kultiviert. Solide YPD-Medium wird durch Zugabe von 2% Agar vor dem Autoklavieren Medium vorbereitet. <ol><li> Um eine Kultur von C. vorbereiten glabrata, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus dem Agar-Platte mit einer sterilen Einweg-Schleife und impfen in 10 ml YPD-Flüssigmedium und Inkubation für 14-16 h mit Schütteln (200 rpm) bei 30 ° C </li><li> Zentrifuge dieser Kultur (1 ml) bei 4000 Upm (1800 × g) für 5 min in einer Tischmikrozentrifuge, waschen Sie die Zellen dreimal mit sterilem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) und Aussetzung Zellpellet in 1 ml PBS. </li><li> Messung der OD 600 C. glabrata Zellsuspension verdünnt und mit einem geeigneten Volumen an steriler PBS auf eine Dichte von 2 x 10 6 Zellen / ml zu erhalten (OD 600= 0.1). Alternativ kann die gewünschte Zelldichte durch Zählen Hefezellen mit einer Zählkammer erreicht werden. </li></ol> 3. Infektion von THP-1 Makrophagen mit C. glabrata Zellen <ol><li> In 50 ul C. glabrata Zellsuspension auf THP-1-Makrophagen (10 6 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte), um ein MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,1 zu erhalten, und Inkubieren Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Um lebensfähig Hefe zählt zu bestimmen, verdünnte 50 ul C. glabrata Zellsuspension 100-fach in sterilem PBS und Platte 100 ul auf YPD-Festmedium. Platten bei 30 ° C und zählen die Anzahl der manuell Hefe-Kolonien nach 1-2 Tagen erscheinen. Diese Zahlen werden von nun an, wie hr 0 C bezeichnet werden glabrata KBE (koloniebildende Einheiten). </li><li> Nach 2 h Co-Kultivierung von THP-1-Zellen mit C. glabrata Zellen, Ablagekulturmedium durch Umkehren 24-Loch-Gewebekulturplatte ina Reservoir und vorsichtig waschen dreimal mit sterilem PBS auf vorgewärmten nonphagocytosed extrazellulären C entfernen glabrata-Zellen. Schonwaschschritten mit PBS sind absolut notwendig, um eine vollständige Entfernung aller extrazellulären Hefe, ohne dass Schäden an der THP-1-Makrophagen-Monolage zu erreichen. </li></ol> 4. Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über Kolonie bildende Einheit Assay <ol><li> Lyse C. glabrata THP-1-infizierten Makrophagen in 1 ml sterilem H 2 O 2 min, kratzen sanft auf die Makrophagen-Ablagerungen aus dem Bohrloch zu entfernen und sammeln Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mikroskopische Prüfung von kompletten Makrophagen-Lyse ist entscheidend für die Wiederherstellung aller verinnerlicht Hefe. </li><li> Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung des Lysats in sterilem PBS, Platte 100 ul auf YPD-Festmedium Platten und Inkubation bei 30 ° C </li><li> Nach 1-2 Tagen rechnen manuell die Anzahl der C glabrata Kolonien, aperschien auf YPD-Medium, multiplizieren mit Verdünnungsfaktor (2 Std. KBE) und berechnen Phagozytose Geschwindigkeit, die der Prozent der C bezieht sich glabrata Zellen, THP-1 durch Makrophagen nach 2 h Koinkubation aufgenommen unter Verwendung der folgenden Formel. % Phagozytose = [(KBE bei 2 h) / (CFU bei 0 h)] x 100 </li><li> Um die Rate der intrazellulären Replikation von C messen glabrata Zellen in THP-1-Makrophagen, sammeln intrazellulären Hefe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, dh. 4, 6, 8, 10, 12 und 24 h, durch Wiederholen der Schritte von 3,3 bis 4,3. </li><li> Berechnen fach Überleben / Replikation von C. glabrata Zellen THP-1 in Makrophagen durch Division der Gesamtzahl CFUs zu einem bestimmten Zeitpunkt mit den in 2 h (phagozytiert Hefe). </li></ol> 5. Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie <ol><li> Nach den in Abschnitt 1 beschriebenen Schritte, Saatgut PMA-behandelten 5 x 10 5 THP-1-Zellen in jeder Vertiefung von zwei vier-und Kammer-Objektträgern und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 12 Stunden. </li><li> Ersetzen Sie alte Medium mit vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen aus PMA-Behandlung für 12 Stunden zu erholen. </li><li> Bereiten GFP (green fluorescent protein)-markierten C glabrata Zellsuspension, wie in Abschnitt 2 beschrieben, und infizieren zu THP-1-Makrophagen zu einer MOI von 1. Wenn C. glabrata GFP-exprimierenden Stämme sind nicht verfügbar, Hefe-Zellen mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markiert ist, kann verwendet werden, um zu überwachen frühen Ereignisse nach der Infektion nämlich. Phagozytose Rate und phagolysosomale Reifung bei 2 Stunden. </li><li> Folien für 2 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO 2, invertieren sie sorgfältig zu waschen Medium verwerfen und 3x mit sterilem, vorgewärmtes PBS. </li><li> Add 500 ul vorgewärmten RPMI-1640-Komplett mediUM zu jeder Kammer von einer Folie und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 22 Stunden. </li><li> Um dies zu beheben 2 h C glabrata-THP-1-infizierten Makrophagen, 500 ul 3,7% Formaldehyd (in PBS) zu jeder Kammer des anderen Schlitten und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln. </li><li> Wash schieben dreimal mit PBS, 500 ul Triton-X (0,7%), und bei Raumtemperatur für 5 min im Dunkeln. </li><li> Wash Rutsche 3x mit PBS, entfernen Kammer von Kulturträger und Luft trocknen Sie es für 3-5 min im Dunkeln. </li><li> Vorsichtig aufsetzen eines Deckglases mit Vectashield Montage-Medium mit DAPI (4 &#39;,6-Diamino-2-phenylindol) auf Folie Blasenbildung zu vermeiden. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit mit Kimwipe und dichten Deck Ränder mit Nagellack. Schiebespeicher im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5,4 und von 5,6 bis 5,9 zu verarbeiten THP-1-Zellen 24 Stunden nach der Infektion. </li><li> Bildzellen unter Verwendung eines Laser-Scanning-confoMikroskope (60X Ölimmersionsobjektiv, Anregung bei 405 nm und 488 nm für DAPI und GFP-Färbung, beziehungsweise). </li></ol>

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N., Balusu, S., Gorityala, N., Dandu, L., Kaur, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomic+analysis+of+Candida+glabrata-macrophage+interaction.">Functional genomic analysis of Candida glabrata-macrophage interaction.</a> PLoS Pathog. 8 (8), e1002863 (2012).</li><li>Roetzer, A., Gratz, N., Kovarik, P., Sch&#252;ller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+supports+Candida+glabrata+survival+during+phagocytosis.">Autophagy supports Candida glabrata survival during phagocytosis.</a> Cell Microbiol. 12 (2), 199-216 (2010).</li><li>Theus, S. A., Cave, M. D., Eisenach, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+THP-1+Cells:+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates.">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li><li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line,+THP-1,+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene.">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li><li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence.">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li><li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+leukemia+cell+line,+THP-1:+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation.">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li><li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester.">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li><li>Casta&#241;o, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata.">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von opportunistischen Pilzinfektionen. Makrophagen tragen zur Verteidigung durch die Einnahme und Zerstörung der Pilzerreger Antimykotika. Somit wird Aufklärung von Faktoren, die für das Überleben und / oder Bekämpfung der antimikrobiellen Funktionen erforderlich sind Makrophagen unser Verständnis von Pilz Virulenz Strategien voraus. In diesem Zusammenhang haben wir ein in-vitro-Zellkultur-Modellsystem unter Verwendung von Makrophagen aus...

Candida-Spezies sind die führende Ursache von lebensbedrohlichen invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten ein. Candida glabrata, einer aufstrebenden nosokomiale Erreger, ist die zweite oder dritte am häufigsten isolierten Candida-Spezies aus Intensivstation Patienten, abhängig von der geographischen Lage 3.1. Phylogenetisch, C. glabrata, einem haploiden Hefezellen, enger mit den nicht pathogenen Modell Hefe Saccharomyces cerevisiae als pathogene Candida spp. einschließlich C. 4 albicans. In Übereinstimmung damit, C. glabrata fehlen einige Schlüsselpilz Virulenz inklusive Gegen, sekretierten proteolytischen Aktivität und morphologische Plastizität 4-5. Obwohl C. glabrata bildet keine Hyphen, es zu überleben und zu replizieren in murinen und humanen Makrophagen 6-8 was darauf hindeutet, dass es einzigartig Pathogenese-Mechanismen entwickelt wurden, können. Nur begrenzte Informationen über die Strategien zur Verfügung, die C. glabrata beschäftigt, um zu überleben nährstoffarmen intrazellulären Makrophagen Umwelt und oxidative und nicht-oxidative entgegenzuwirken Wirtsreaktionen von Immunzellen 5 montiert. Ein entsprechendes Modell Makrophagen-System ist eine Voraussetzung, um die Wechselwirkung von C abgrenzen glabrata mit Wirts Phagozyten über funktionelle Genom-und Proteom-Ansätzen. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) des humanen und murinen Ursprungs sind, sind früher verwendet worden, um die Wechselwirkung von C zu studieren glabrata mit Wirtsimmunzellen 7,9. , Schwierigkeiten bei der Beschaffung von PBMCs und BMDMs, ihre begrenzte Lebensdauer und intrinsische Unterschiede zwischen den verschiedenen Säugetier Spender beschränken jedoch die Verwendung dieser Zellen als vielseitige Modellsysteme. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung eines in vitro-System, das intracellul studierenar Verhalten von C. glabrata Zellen in Makrophagen aus menschlichen Monozyten-Zelllinie THP-1 abgeleitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls war es, eine einfache, kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Zellkultur-Modellsystem, die leicht manipuliert werden kann, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pilz-Pathogen-Interaktion untersuchen zu erlassen. THP-1-Zellen wurden bereits verwendet, um die Immunantwort gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze 10-12 entziffern. Monozytären THP-1-Zellen sind leicht zu pflegen und kann unterschieden werden, bei Phorbolester-Behandlung, um Makrophagen, Monozyten-Makrophagen der menschlichen Mimik und Express entsprechenden Makrophagen-Marker 13. Die wichtigsten Vorteile der THP-1-Makrophagen-Modellsystem sind die einfache Bedienbarkeit und das Fehlen von hoch entwickelten Geräten Anforderung. Die hier vorgestellte Protokoll ist leicht anpassbar, um die Interaktion von anderen menschlichen Pilzerreger mit hos studierenT-Immunzellen. Das derzeitige Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Virulenzfaktoren für die Krankheitserreger von Interesse mit hohem Durchsatz nach Mutanten zu identifizieren. Diese Proof-of-concept wurde durch die erfolgreiche Anwendung von THP-1-Kulturmodellsystem, um einen Satz von 56 Genen, die für das Überleben von C. glabrata in humanen Makrophagen 8 erforderlich sind beispielhaft zu identifizieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:40px;width:163px;">THP-1</td>
			<td style="width:105px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:85px;">TIB 202</td>
			<td style="width:243px;">Human acute monocytic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:105px;">Hyclone</td>
			<td style="width:85px;">SH30096.01</td>
			<td style="width:243px;">For maintaining THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">P 8139</td>
			<td style="width:243px;">Caution: Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">YPD&#160;</td>
			<td style="width:105px;">BD-Difco</td>
			<td style="width:85px;">242710</td>
			<td style="width:243px;">For growing Candida glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">F8775</td>
			<td style="width:243px;">For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,&#160; pH 7.4) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Saline-sodium citrate (SSC)&#160;</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Prehybridization buffer</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (50% formamide, 5x Denhardt&#8217;s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">VECTASHIELD mounting medium</td>
			<td style="width:105px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:85px;">H-1200</td>
			<td style="width:243px;">For mounting slides for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">32P-labeled &#945;-dCTP</td>
			<td style="width:105px;">JONAKI-BARC</td>
			<td style="width:85px;">LCP-102</td>
			<td style="width:243px;">For radiolabeling of signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">100 mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">430167</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">24-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">3527</td>
			<td style="width:243px;">To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">4-chamber tissue culture-treated glass slide</td>
			<td style="width:105px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:85px;">REF354104</td>
			<td style="width:243px;">To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:105px;">Rohem India</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">For enumeration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Table top microcentrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:85px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in microtubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Remi</td>
			<td style="width:85px;">R-8C</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in 15 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:85px;">Ultraspec 10</td>
			<td style="width:243px;">To monitor absorbance of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Plate incubator</td>
			<td style="width:105px;">Labtech</td>
			<td style="width:85px;">Refrigerated</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:85px;">Innova 43</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Water jacketed CO2&#160; incubator</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Electron Corporation</td>
			<td style="width:85px;">Forma series 2</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:105px;">Carl Ziess</td>
			<td style="width:85px;">Ziess LSM 510 meta&#160;</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:85px;">CKX 41</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata and THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">PCR machine</td>
			<td style="width:105px;">BioRad&#160;</td>
			<td style="width:85px;">DNA Engine</td>
			<td style="width:243px;">To amplify unique tags from input and output genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:105px;">Labnet</td>
			<td style="width:85px;">Problot 12S</td>
			<td style="width:243px;">For hybridization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PhosphorImager</td>
			<td style="width:105px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:85px;">FLA-9000</td>
			<td style="width:243px;">For scanning hybridized membranes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:85px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:243px;">For denaturation of radiolabeled signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:163px;">Gel documentation unit</td>
			<td style="width:105px;">Alphainnontech</td>
			<td style="width:85px;">Alphaimager</td>
			<td style="width:243px;">To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an in vitro system to study intracellular behavior of candida glabrata in human thp-1 macrophages

Eine Zellkultur-Modellsystem, wenn ein enger Mimik von Host-Umweltbedingungen können als preiswerte, reproduzierbare und leicht manipulierbare Alternative zu Tiermodellsysteme für die Untersuchung von einem bestimmten Schritt der mikrobielle Erreger der Infektion dienen. Eine menschliche Monozyten-Zelllinie THP-1, welche bei Phorbolester-Behandlung wird in Makrophagen unterscheiden, wurde bereits früher verwendet, um die Virulenz Strategien vieler intrazelluläre Erreger wie Mycobacterium tuberculosis studieren. Hier ein Protokoll, ein in vitro Zellkulturmodell zu erlassen diskutieren wir System mit THP-1 Makrophagen, um die Wechselwirkung eines opportunistischen Pathogens menschlichen Hefe Candida glabrata mit Host phagozytischen Zellen abzugrenzen. Dieses Modellsystem ist einfach, schnell, offen für Hochdurchsatz-Mutante Bildschirme, und erfordert keine hoch entwickelten Geräten. Eine typische THP-1-Makrophagen-Infektionsversuch dauert ca. 24 Stunden mit einer zusätzlichen Stunde 24-48 wiederhergestellt intrazellulären ermöglichenHefe auf reichen Medium für koloniebildende Einheit-basierte Analyse Rentabilität wachsen. Wie andere in-vitro-Modellsysteme, ist eine mögliche Einschränkung dieses Ansatzes Schwierigkeiten bei Extrapolation der zu einer sehr komplexen Immunzellschaltkreis in den menschlichen Wirt vorhandenen erzielten Ergebnisse. Trotz dieser, ist jedoch die aktuelle Protokoll sehr nützlich, um die Strategien, die eine Pilzerreger verwenden kann, zu umgehen / entgegenzuwirken antimikrobielle Reaktion und zu überleben, anzupassen, und vermehren sich in den nährstoffarmen Umfeld von Wirtsimmunzellen aufzuklären.

Infektion Analysen von PMA-behandelten THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata Wildtyp (wt)-Zellen ergab, dass Gew. Zellen durch Makrophagen mit einer Rate von 55-65% nach 2 h Koinkubation phagozytiert. Weitere, C. glabrata Zellen konnten Tötung von THP-1-Makrophagen wider und unterzog sich einer moderaten 5 - bis 7-fachen Anstieg der KBE nach 24 h Kokultur mit THP-1-Makrophagen 8. Intrazelluläre Replikation von Wildtyp-Zellen, transformiert mit GFP-exprimierenden Plasmid,...

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Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Der aktuelle Artikel beschreibt ein Protokoll, um eine In-vitro-Zellkultur-Modellsystem, um die Interaktion einer fakultativ intrazellulären Humanfunguspathogen Candida glabrata mit menschlichen Makrophagen, die ein nützliches Werkzeug, um unser Wissen von Pilz Virulenzmechanismen voranzubringen studieren zu etablieren.

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

establishment-an-vitro-system-to-study-intracellular-behavior-candida

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

11.5K Aufrufe.  Centre for DNA Fingerprinting and Diagnostics, Andhra Pradesh, India.  Der aktuelle Artikel beschreibt ein Protokoll, um eine In-vitro-Zellkultur-Modellsystem, um die Interaktion einer fakultativ intrazellulären Humanfunguspathogen Candida glabrata mit menschlichen Makrophagen, die ein nützliches Werkzeug, um unser Wissen von Pilz Virulenzmechanismen voranzubringen studieren zu etablieren. 

Serie: Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Hocheffiziente Transfektion von humanen THP-1 Makrophagen durch Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

Anlegen eines induzierbaren Expression System zu Störungen der bakteriellen Virulenzfaktoren mit Intrazelluläre Signal Studieren

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

Hocheffiziente Transfektion von primärer Makrophagen mit In Vitro transscribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...