Die Aufrechterhaltung der potenziellen Lebensfähigkeit von Eizellen nach langfristiger Lagerung stellt ein Instrument großer Chancen dar, da es die Haustierzucht durch genetische Selektionsprogramme verbessern, zur Erhaltung der Biodiversität durch den Schutz von Wildtierarten beitragen und die Forschung in der Biotechnologie verstärken würde. Die Vitrifikation der juvenilen Eizellen war im Generationsintervall in Zuchtprogrammen viel kürzer. Vitrifaktion durch ultraschnelle Kühlung und Erwärmung gilt als Standardansatz bei der Erhaltung von Rinder-Eizellen.
Bei Schafen gilt dieses Verfahren jedoch noch als relativ neu und es fehlt eine Standardmethode. In diesem Video beschreiben wir ein Protokoll für die Vitrifikation von Schafseigen, die sowohl von juvenilen als auch von erwachsenen Spenderinnen gesammelt und in vitro vor der Kryokonservierung gereift sind. Das Protokoll umfasst alle Verfahren von der In-vitro-Reifung, Vitrifikation, Erwärmung und Nacherwärmungskultur.
Nach der Wiederherstellung des Cumulus-Eizellkomplexes, der in vitro für 24 Stunden in statisch gereift ist, ein Zustand, der für juvenile Eizellen die Supplementierung mit hundert Mikromolaren Trehalose im Reifemedium umfasst. Nach der In-vitro-Reifung wurden die Eizellen durch sanftes Pipettieren mechanisch von Cumulus-Zellen entkernt und unter einem Stereomikroskop mit 60-facher Vergrößerung untersucht. Die Auswahl der Eizellen, die bei den Vitrifikationsverfahren eingereicht werden sollen, stellt den ersten wichtigen Schritt dar, um die erfolgreiche Anwendung dieses Verfahrens zu garantieren.
Nur diejenigen mit dem gleichmäßigen Zytoplasma, mit homogener Verteilung der Lipidtröpfchen, Integrität der ganzen Emma breiten und kontinuierlichen Pivotal im Raum, kompakte Zona pellucida mit einem Außendurchmesser von etwa 19 Mikrometern und der Extrusion des ersten Polkörpers und damit im M2-Stadium müssen ausgewählt werden. Die Vitrifikation wurde mit der Methode des minimalen essentiellen Volumens mit einem Kryotops-Gerät durchgeführt. Nach der Selektion wurde eine Gruppe von fünf juvenilen Eizellen für zwei Minuten bei 38,5 Grad Celsius im Basismedium konditioniert.
Die Eizellen wurden dann durch drei Minuten Exposition bei einer Kalibrierlösung dehydriert. Die Belastung der Eizelle in das verwendete Vitrifikationsgerät ist ein wichtiger und kritischer Schritt. Cryotop verwendet einen Polypropylenstreifen, der an einem Halter befestigt ist.
Bei dieser Methode werden die Eizellen in der Vitrifikationslösung, weniger als 0 Punkt Milliliter, schnell mit einer Glaskapillare auf dem Filmstreifen belastet. Dann muss die Lösung entfernt werden, wobei eine dünne Schicht zurückbleibt, die ausreicht, um die zu kryokonservierenden Zellen zu bedecken. Vor dem Laden in das Cryotop-Gerät und das direkte Eintauchen in flüssigen Stickstoff innerhalb von 30 Sekunden.
Für eine warme biologische Innentemperatur wurde der Gehalt jeder Vitrifikationsvorrichtung von flüssigem Stickstoff in 200 Mikrolitertropfen abnehmender Trehaloselösung übertragen. Eizellen wurden übertragen, wobei die Eizellen mit einer dünnen Glaspipette gezogen wurden, um die Entfernung von intracelulären Kryoprotektoren zu fördern. Schließlich wurden die Eizellen in einem Basismedium im Inkubator in 5% Kohlendioxid vorgezüchtet.
Unmittelbar nach der Erwärmung und für jeden Zeitpunkt der Posterwärmungskultur wurden die Eizellen morphologisch mit einem invertierten Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung bewertet. Die Kryotoleranz von Eizellen von juvenilen Spenderinnen ist geringer als bei veränderten Eizellen mit geringerer Membranintegrität nach der Erwärmung. Die Verwendung von Trehalose im Reifungsmedium induziert in juvenilen Eizellen eine höhere Membranintegrität, wodurch die Überlebensraten nach der Vitrifikation erhöht werden.
Spaltung, Befruchtung und Entwicklungsraten von juvenilen Eizellen wurden jedoch nicht durch Trehalose-Supplementierung erhöht. Die Verwendung von Medien mit einer Kalziumkonzentration von 2,2 Milligramm Deziliter für die Vitrifikation von juvenilen Eizellen sollte höhere Befruchtungsraten im Vergleich zu Eizellen mit Kalziumkonzentration verglast haben, aber es wurden keine Unterschiede gefunden, die die Produktion ermöglichen. Durch den Vergleich der Post-Erwärmungskultur auf verschiedenen Daueren zeigten wir, dass eitätige Eizellen, die von älteren beiden Personen gesammelt wurden, nach vier Stunden Kultur in der Lage sind, die energetischen Bindungen und den mikrotubularen Aufbau wiederherzustellen und die Entwicklungskompetenz mit höherer Spaltung und Blastozytenabfall wiederherzustellen.
Die mitochondriale Aktivität war in vitrifizierten warmen juvenilen Eizellen nach vier Stunden Posterwärmungskultur im Vergleich zu anderen Zeitpunkten höher. Die mitochondriale Verteilungsteilung änderte sich auch während sechs Stunden nach der Erwärmungskultur. Darüber hinaus waren die intrazellulären Spiegel reaktiver Sauerstoffspezies in juvenilen Eizellen nach zwei Stunden Nacherwärmungskultur signifikant niedriger als in 0, 4 und 6 Stunden.
Im Gegensatz zu dem, was in anderen Eizellen gefunden wurde, stiegen die Raten der spontanen parthenogentischen Aktivierung während der Post-Erwärmungskultur in juvenilen Eizellen. Einer der Hauptvorteile der vorgeschlagenen Methode ist, dass sie alle Schritte von der Eizellentnahme bis zur In-vitro-Reifung, Vitrifikation und Erwärmung umfasst. Darüber hinaus umfasst es eine Kulturperiode nach der Erwärmung, um die Genesung der Eizellen von den während des Vitrifikationsverfahrens entstandenen Schäden zu ermöglichen.
Die Wahl des optimalen Zeitpunkts für die Befruchtung ist eine Herausforderung und kann sich auf das Ergebnis des Vitrifikationsprogramms auswirken. Es sollte auch berücksichtigt werden, dass die Vitrifikation im Gegensatz zum langsamen Einfrieren eine manuelle Technik ist und daher vom Bediener abhängig ist. Aus diesem Grund ist eine große Herausforderung der Bedarf an qualifizierten Technikern und Forschern, die den Bedienereffekt bei der Bewertung des Ergebnisses des Vitrifikationsprogramms berücksichtigen.
Weitere Studien aus unserem Labor werden es ermöglichen, das Vitrifikationsverfahren und die Auswahl von Eizellen zu standardisieren und die Medienzusammensetzung besser auf die Bedürfnisse der juvenilen Eizelle abzustimmen. Eine Missachtung der Verwendung von Kultur und Charakter und Antioxidans bieten wir vielversprechende Möglichkeiten.
