We would like to thank the Texas Pierce&#8217;s Disease Research and Education Program and USDA-APHIS for their funding support for this project. We would also like to thank Hema Kothari at the University of Texas Health Science Center at Tyler for her assistance with confocal microscopy.

1. Zellkultur HINWEIS: Homalodisca vitripennis von der Dr. Wayne Hunter Labor an der USDA Agricultural Research Service (. Ft Pierce, FL USA) etablierten Zelllinien wurden verwendet, um einem Labor stock gemischten Zellstadien einschließlich Anfangs Fibroblasten und Monoschichten zu initiieren. <ol><li> Führen Sie die folgenden Verfahren in einer sterilen Laborumgebung in einem Temperaturbereich von 20-24 ° C mit 25 cm 2 Kulturflaschen gehalten. </li><li> Kultivieren und Kulturen mit H2G + Leafhopper Medium, eine modifizierte WH2 Honigbiene Medien 10 (Tabelle 1) zu halten in 25 cm 2 Zellkulturflaschen. </li><li> Kulturkolben inkubieren bei 24 ° C mit ~ 53% Luftfeuchtigkeit. </li><li> Verwenden Sie einen umgekehrten Mikroskop bei einer Gesamtvergrößerung (TM) von 100X zu Kultur Wachstum zu überwachen, zB auf eventuelle abnorme Zellwachstum überwachen für eventuelle Verunreinigungen und prüfen Wachstum Fortschritte in der Sackgassetur Oberfläche. </li><li> Führen Sie eine vollständige Mediumwechsel (~ 4 ml Kulturmedium pro Kolben) alle 7 - 10 Tagen, ohne die Kulturfläche zu stören. </li><li> Kulturen passieren, wenn das Kulturfläche von etwa 80% des Zellwachstums (konfluent) unter Verwendung von 0,25% Trypsin enthält, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um Zellen zu dissoziieren bedeckt. Fügen ~ 2 - 3 ml Trypsin zu jeder Kulturflasche und setzen Kultur (en) für das Enzym für kurze Zeit (5 - 10 min), um eine vollständige Zell-Dissoziation zu erzielen. </li><li> Füge eine gleiche Menge an frischem Medium zu dem Kulturgefäß (en) (~ 2 - 3 ml) auf die Enzymaktivität zu stoppen und übertragen die gesamte Lösung in ein konisches Rohr zum Zentrifugieren. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 4 ° C für 6 min bei 350 x g beträgt. </li><li> Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und fügen ~ 8 ml frisches Medium zu jedem Röhrchen. Sanft homogenisieren Zellen mit einer Pipette. </li><li> Split Kulturen bei einem 1: 2-Verhältnis von 25 cm 2-Kolben (ca. 4 ml Zell solutiauf pro Kolben) und lassen frisch geleitet Kulturen ungestört für 48 Stunden, sodass die Zellen in Suspension zu fest an der Oberfläche des Kolbens verbinden. HINWEIS: Die Kultivierung der Zellen in 48-Well-Gewebekulturplatten mit sterilen mit einer Wachstumsfläche von 1 cm 2 ist ebenfalls möglich, und sie können in der gleichen Weise wie Kulturflaschen mit einer Verringerung des Volumens des Kulturmediums auf ~ 250 ul gehalten werden. </li></ol> 2. Ganzvirus-Extraktion <ol><li> Homogenisieren ganzen Körper des Virus positive H. vitripennis in Phosphatpuffer, pH ~ 7,2, mit 0,02% Natrium-Trihydrat (DETCA) durch Vortexen für ~ 10 Sekunden-Intervallen, bis es keine weitere große Klumpen von Gewebe vorliegen. Extrahieren Virus durch Super Zentrifugation bei 124.500 xg für 4 h bei 4 ° C oder 22.000 × g für 16 h bei 4 ° C ist. Wenn ein Niederschlag bildet an der Spitze, entfernen Sie sie mit einem sterilen Wattestäbchen 11. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Sammeln Sie die Pellet-undAuflösen mit 5 ml 10 mM Phosphatpuffer (kein DETCA), pH ~ 7,2, die 0,4% Na-Desoxycholsäure und 4% Polyethylenglykol Hexadecylether (Brij 52). <ol><li> Um das Pellet gut mischen, entfernen Sie das Pellet von der Seite der Röhre und zerquetschen, bis in der Lösung, wenn nötig. </li><li> Noch 10 mM Phosphat-Puffer in ~ 5 ml-Schritten zu helfen, das Pellet in Lösung gehen, wenn nötig und kombinieren in 2 Röhren 11. </li></ol></li><li> Zentrifugieren Sie die Lösung bei 300 g für 15 min 11. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und die heiße Lösung durch einen 0,45-um-Filter, und das Filtrat in großen Sammelrohr 11. </li><li> Übertragungs Filtrat einer Dialysemembran mit einer Molekulargewichtstrenngrenze (MWCO) von 3,5 kD, mit kleinen Mengen von 10 mM Phosphatpuffer (pH 7) nicht enthält, wenn nötig DETCA 11. </li><li> Platzieren der Dialysemembran in ein großes Becherglas mit ddH 2 O bei 4 ° C gefüllt. Ändern Sie die ddH2O jede Stunde foder 5 - 6 Stunden, bis sich ein weißer Niederschlag bildet in der Membran 11. </li><li> Sammeln des gereinigten Virus in der Membran und unterziehen die 100% Virus-Lösung zu einer 10-fachen Verdünnungsreihe durch Zugabe von 10 ul der Lösung zu 90 ul ddH 2 O. Anschließend weitere 90 ul ddH2O hinzufügen 10 ul der Verdünnung bis zu einer Verdünnung von 1: 100.000. </li><li> Shop-Virus-Lösung bei -80 ° C. </li></ol> 3. Virusreplikation <ol><li> Samenzellen in 48-Well-Kulturplatten wachsen, bis alle Zeilen Zellwachstum beträgt 80% konfluent (etwa 72 Stunden nach der Pass, wenn Zellen mit einer durchschnittlichen Rate wächst). </li><li> Impfen jede Zeile von Zellen mit der Serien verdünnten Virus einmal das Zellwachstum erreicht Konfluenz, dh eine Zeile einer Verdünnung von 1:10, eine Zeile einer 1: 100 Verdünnung, usw., mit Ausnahme der oberen Reihe. Verwenden Sie die obere Reihe als Kontrolle und fügen Sie 10 ul ddH 2 O in jede Vertiefung als Lautstärkeregler. <ol><li> Um eine Ausgangsbasis erhoben Zellkonzentration für den Vergleich mit experimentellen Zellzahl vor der ersten Impfung aller Brunnen in den Kulturen mit dem Virus zu schaffen, distanzieren und zählen Sie die erste gut jeder Zeile. </li></ol></li><li> Überwachen Kulturplatten alle 24 h nach der Virusimpfung für eine Farbänderung in dem Medium, das eine pH-Veränderung und Änderung in der Zellmorphologie. </li><li> Bild einer Spalte der Testplatte zu jedem Zeitpunkt, mit einem inversen Mikroskop bei 100-facher TM. </li><li> Entfernen Sie alle Medium aus der Spalte, die bei jedem 24-Stunden-Zeitpunkt abgebildet wurde und speichern sie kurzfristig bei -20 ° C für die RNA-Extraktion und Quantifizierung viraler oder langfristig bei -80 ° C. </li><li> Distanzieren Zellen aus den Vertiefungen nach der Entfernung des Mediums, wie zuvor beschrieben, in den Schritten 1.6 - 1.9 mit nur ~ 250 ul 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität und ~ 250 ul frisches Medium zu stoppen zum Resuspendieren der Zell Pellet. </li><li> Fügen Sie 10 ul von 0,4% Trypanblau-Färbung zu jedem Röhrchen mit Zellen zu Zellzahlen nach der Zell Dissoziation für jeden Zeitraum von 24 h über eine Woche durchzuführen. Ermöglichen Fleck für 10 min, bevor Zellzahlen zu sitzen. <ol><li> Führen Zellzahlen innerhalb 1 h der Exposition gegenüber Flecken oder lebensfähige Zellen zu färben beginnt und nicht lebensfähigen Zellen Aufnahme. </li></ol></li><li> Langsam 10 ul der gefärbten Zelllösung zu jeder Seite eines Standard-Hämozytometer unter Verwendung einer Mikropipette. Lassen Sie die Lösung durch Kapillarwirkung aufgenommen werden, um Luftblasen zu vermeiden. </li><li> Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen (nicht fleckig) Zellen auf beiden Seiten der Zählkammer (das Äquivalent von 4 zählt der 16 Plätze in der Zählkammer). Führen Zellzahlen für jede Vertiefung der Spalte, die entfernt wurde. </li><li> Der Mittelwert der Zellzahlen aus jeder Spalte und verwenden Sie die folgende Formel, um die Gesamtzellzahl-Nummer zu erhalten: (Anzahl der Zellen / 4) x Verdünnungsfaktor = Anzahl der Zellen x 10 <sup&gt; 4 ml. Dies ist die Zelldichte oder die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Kultur. </li></ol> 4. Virus Extraktion aus Zellkultur <ol><li> Entfernen behandelt H. vitripennis Zellen aus Kulturflaschen wie zuvor in den Schritten 1.6 beschrieben - 1.8, mit nur ~ 250 ul von 0,25% Trypsin-EDTA und frisches Medium, um die Enzymaktivität zu stoppen. </li><li> Überstand verwerfen. </li><li> Auszug Virus von Kulturzellen nach dem Protokoll zuvor in Schritten 2.3 - 2.8. </li></ol> 5. RNA-Extraktion <ol><li> Extrahieren von RNA aus Proben, die während jedes Medium eine Woche Virus Versuch unter Verwendung eines Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion für flüssige Proben nach Herstellerprotokoll, gesammelt. </li><li> Speicher extrahierten Proben bei -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Virus etablieren Standards für RT-PCR, indem Sie traditionelle PCR unter Verwendung derPrimerpaar HoCV RT-PCR-Primer 1 (vorwärts 5&#39;-GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, 5&#39;-Reverse ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;), mit einem Virus zu isolieren, aus ganzen Körper H. vitripennis. </li><li> Gegenstand PCR-Produkts einer Elektrophorese für 60 min in einer 2% igen Agarose-Gel, enthaltend 0,1% Ethidiumbromid-Gel bei 120 V. </li><li> Auszuschneiden die Bands aus dem Gel und reinigt mit einem Gel-Extraktions-Kits nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Pool alle ausgeschnitten und aufgereinigt Produkt weiter zu reinigen und durch Grundethanolfällung. Zugeben und das Fällungsprodukt in etwa 30 ul Tris EDTA (TE), um die Gesamtprobenkonzentration zu erhöhen. </li><li> Quantifizierung der Ebene der cDNA in gepoolten Proben über Spektrophotometrie mit 260/230 Wellenlänge Einstellungen für Nukleinsäure-Nachweis. </li><li> Führen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe des gereinigten Probe von 57 ng / ul bis 57 ag / ul (10 -18). Führen die Verdünnungs ähnlich der beschriebenen in 2,8 Anpassungen für den Unterschied in der Konzentration Anforderungen gestellt. </li><li> Bestimmen Nachweisgrenzen der Verdünnungsreihe, indem qRT-PCR unter Verwendung eines qRT-PCR-Kit mit zuverlässige Quantifizierung von Low-Fülle-Transkripte. HINWEIS: Viral-Konzentrationen von weniger als 5 x 10 -3 Kopien sind nicht nachweisbar. </li><li> Extrahieren von RNA aus Versuchsproben, wie zuvor in Schritt 5.1 beschrieben und quantifiziert unter Verwendung von Spektrophotometrie analysiert. </li><li> Normalisieren alle extrahierten Proben bis 5 ng / ul mit Nuklease freiem Wasser. </li><li> Führen qRT-PCR bei allen Proben, in Dubletten, 25 ul Reaktionen mit Hilfe eines Ein-Schritt-qRT-PCR-Kit mit der Fähigkeit zu einer geringen Kopienzahl spüren wie folgt: 50 ° C zu halten für 10 min; 95 ° C halten für 5 min; 30 Zyklen von 95 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec; schmelzen 50-99 ° C für 5 s auf jedem Schritt. <ol><li> Machen Sie den Master-Mix, so dass jeder Reaktionsgemisch enthält 12,5 ul 1x Master-Mix, 1,0 ul (0,3 uM) von Vorwärts-Primer, 1,0 ul (0,3 uM) der Reverse-Primer, 0,25 ul der reversen Transkriptase und variable Mengen an Template auf Basis von Standardisierung Werte. </li><li> Bringen die Gesamtreaktionsvolumen auf 25 ul mit RNase freiem Wasser. </li><li> Gehören fünf Standard-Konzentrationen in jedem PCR-Lauf mit den folgenden Kopienzahl: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4 und 5 x 10 -2 Exemplaren. Die Schwelle für jeden Durchgang, um nur unter einem Fluoreszenz von -2,5 bis 10x Rauschen während frühen Erwerb zu Beginn jedes Durchlaufs zu verringern. </li></ol></li></ol> 7. konfokale Mikroskopie <ol><li> Wachsen Homalodisca vitripennis Zellen in einem zwölf Well-Platte mit Deckgläschen Mess 18 mm Durchmesser in jede Vertiefung. </li><li> Beimpfen von einer Spalte auf der Platte alle 24 Stunden für einen Zeitraum von vier Tagen, wenn eine Monoschicht erreicht wird. Sicherzustellen, dass jedes cPALTE auch eine Steuer, eine niedrige Virusverdünnung (1:10) gut und eine hohe Virusverdünnung (1: 100.000) gut. Verwenden von Schritt 2.8 erhalten Virus-Lösungen. </li><li> Entfernen Sie alle Medien auf dem fünften Tag und waschen die Zellen zweimal mit 1x PBS (pH 7,4). </li><li> Fixierung der Zellen mit kaltem 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C für 30 min. </li><li> Gib 500 ul 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu den Zellen und waschen sie für 10 min bei RT auf einem Schüttler bei niedriger Geschwindigkeit. Dreimal Waschen Sie die Zellen. </li><li> Gib 500 ul 0,1% Triton X-100 zu den Zellen, um sie zu permeabilisieren. Lassen Sie sich für 10 min bei RT. </li><li> Wasche die Zellen erneut, wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben. </li><li> Gib 500 ul einer 5% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung zu den Zellen bei RT blockieren. Lassen Sie sitzen für 2 Stunden und dann zu entfernen. </li><li> Verdünnen Lager Rhodamin rot-Phalloidin (RCP) 1: 250 in 1x PBS mit 5% BSA und 250 ul der Verdünnung auf jeweils gut Färbung für F-Aktin. </li><li> Abdeckplatte aus Aluminium fÖl, um den Farbstoff aus Bleich verhindern und Inkubation Zellen bei 4 ° CO / N. </li><li> Entfernen Sie die RCP nach 12 h Inkubation und ersetzen Sie es mit 250 ul 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (250 ug / ml) in 1x PBS mit 5% BSA, um die Kerne der Zellen zu färben . </li><li> Inkubieren der Zellen mit DAPI bei RT für 1 Stunde. </li><li> Waschen Zellen dreimal mit 1x PBS wie zuvor in Schritt 7.5 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Deckgläser aus den Vertiefungen und montieren auf Objektträger mit einer Montage Medien mit einer Anti-Fade Reagenz. </li><li> Die Objektträger trocknen in lichtdichten Kästen, bis unter dem konfokalen Mikroskop betrachtet. Ansicht Präparate so bald wie möglich als Farbstoffe schnell verblassen. </li><li> Bild gefärbten Zellen mit einem konfokalen System mit einem Mikroskop, das eine 63X (Öl) Plan-apochromate Objektiv ausgestattet. <ol><li> Stellen Sie die Laserwellenlängen um 543 ± 10 nm Anregung und 575 ± 10 nm Emissions für Rhoadmine rot-conjucated Phalloidin, Und 369 ± 10 nm Anregung und 450 ± 30 nm Emissions für DAPI. </li><li> Identische Verstärkung und Offset-Einstellungen für den Detektor, um alle Bilder zu erhalten. </li><li> Prozessbilder mit Hilfe geeigneter Software für die Bildverarbeitung und Sortierung und Import gewünschten Bilder in eine Bildverwaltungssoftware. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Steigende Besorgnis über den Zustrom von invasiven landwirtschaftlichen Arten haben zu einer erhöhten Nachfrage nach neuen Methoden, um gegen neue Schädlinge und Krankheitserreger zur Wehr zu führen. Ein Schwerpunkt der Krankheitsprävention und-Management umfasst die Verwaltung von Vektoren und Krankheitserreger war das primäre Ziel dieser Studie. Wirtschaft spielen eine wichtige Rolle bei der Entscheidung, diese Art von Erreger zu Biopestizid Vektoren in der Landwirtschaft verwalten, weil die praktische Anwendung...

Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis Germar 1821) hat als vorherrschende Vektor Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) in Nordamerika 1 identifiziert worden, die Erreger der Pierce-Krankheit der Weinrebe (PD). Insektenpopulation Management hat sich schnell zum Mittelpunkt der Forschung werden in Kalifornien und über den Süden der Vereinigten Staaten gegen diese verheerende Problem für den Weinbau Industrie. Ein positiv Sinn, Einzelstrang-RNA-Virus aus der Familie Dicistroviridae, Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) bei Wild H. identifiziert vitripennis Bevölkerung und gezeigt, dass die Sterblichkeit in diesen Bevölkerungsgruppen 2-4 zu erhöhen, bei gleichzeitiger Senkung des Insekts Widerstand gegen Insektizide. Entwicklung von Methoden, um effektiv hinten infiziert H. vitripennis in einer Laborumgebung Erwachsenenalter schwierig gewesen, weil <em&gt; H. vitripennis unterschiedliche Phase-spezifische Ernährungsbedürfnisse, die eine Vielzahl von Wirtspflanzen 5-8 erfordern. Spezifische Ausstattung und hinten Live H. erforderlich vitripennis in den Vereinigten Staaten; Daher ist die Zellkultur kostengünstiger und eine praktikable Alternative sowie zunehmend wichtig für HoCV-01-Erkennung und Replikation 2,9. Während die grundlegenden Methoden zur Festlegung von Zellkulturen von H. vitripennis beschrieben sind diese Verfahren noch nicht für eine kommerzielle Produktion von biologischen Bekämpfungsmittel verwendet worden, wie beispielsweise Viren 2. Das übergeordnete Ziel der folgenden Verfahren ist es, eine hohe Konzentration von HoCV-01 eignet sich für den Einsatz als biologische Bekämpfungsmittel zu produzieren. Virale Replikation erfordert eine lebende Zelle, weshalb erfolgreich zu kultivieren und zu optimieren H. vitripennis Kulturen ist von entscheidender Bedeutung für den Fortschritt der Herstellung eine gewinnbringende Virus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="595">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:93px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;cell culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430168</td>
			<td>Surface area 25&#160;cm2, canted neck, cap (plug seal)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td>
			<td style="width:93px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Inverted microscope and camera</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>T4049</td>
			<td>0.25%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2&#160;g EDTA &#8226; 4Na per liter of Hanks&#8242; Balanced Salt Solution with phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Greiner CELLSTAR&#160;multiwell culture plates</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8937</td>
			<td>48 wells (TC treated with lid)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">DETCA&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>228680</td>
			<td style="width:167px;">Sodium diethyldithiocarbamate trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Corning&#160;bottle-top vacuum filter system</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS431206</td>
			<td>Cellulose acetate membrane, pore size 0.45&#160;&#956;m, membrane area 54.5&#160;cm2, filter capacity 500&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Brij 52</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>388831</td>
			<td>Polyethylene glycol hexadecyl ether</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate buffer solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5244</td>
			<td>Recieved as 100mM diluted to 10mM with sterile water</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">TRIzol LS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>10296-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5304</td>
			<td>For electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E7637</td>
			<td>BioReagent, for molecular biology, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuantiTect qRT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td>204243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148&#160;</td>
			<td>Reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P5368</td>
			<td style="width:167px;">Phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Rhodamine red-conjugated phalloidin&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>R415</td>
			<td>Rhodamine phalloidin is a high-affinity F-actin probe conjugated to the red-orange fluorescent dye, tetramethylrhodamine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DAPI&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">ProLong Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Life Technologies</td>
			<td>P36934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM510 Meta Confocal System&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LSM Zen 2007 Software</td>
			<td style="width:93px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Grace&#8217;s Insect medium (supplemented, 1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8142</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-histidine monohydrate</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H8125</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 199 (10X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M4530</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Medium 1066 (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0422</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hank&#8217;s Balanced Salts (1X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>51322C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MEM, amino acid mix (50X)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>56419C</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1 M MgCl solution</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pen-Strep (w/ Glutamine)</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G6784</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nystatin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>N6261</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>46305</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td>H2G+ leafhopper medium component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of homalodisca coagulata virus-01 via homalodisca vitripennis cell culture

Die glasartige Flügelscharfschütze (Homalodisca vitripennis) ist ein hoch vagile und polyphagen Insekten gesamten Südwesten der Vereinigten Staaten gefunden. Diese Insekten sind die vorherrschenden Vektoren Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), eine Xylem-Bakterium, das begrenzt die Erreger der Pierce-Krankheit (PD) der Weinrebe ist. Pierce-Krankheit ist wirtschaftlich schädlich; damit, H. vitripennis haben ein Ziel für Erreger-Management-Strategien geworden. Ein dicistrovirus als Homalodisca coagulata Virus-01 (HoCV-01) identifiziert, mit einer erhöhten Mortalität in Verbindung gebracht H. vitripennis Populationen. Da eine Wirtszelle für HoCV-01-Replikation benötigt, stellt der Zellkultur eine gleichförmige Umgebung für die gezielte Replikation logistisch und Biopestizid Produktion wirtschaftlich wertvoll ist. In dieser Studie wurde ein System für großflächige Ausbreitung von H. vitripennis Zellen durch Gewebekultur entwickelt, providing einen viralen Replikationsmechanismus. HoCV-01 wurde aus den ganzen Körper Insekten extrahiert und verwendet, um kultivierte H. inokulieren vitripennis Zellen auf verschiedenen Ebenen. Das Kulturmedium wurde alle 24 h für 168 h, RNA extrahiert und mit qRT-PCR analysiert entfernt. Die Zellen wurden mit Trypanblau gefärbt und gezählt, um die Überlebensfähigkeit Zelle quantifizieren mittels Lichtmikroskopie. Ganzvirus-Partikel wurden bis zu 96 Stunden nach der Infektion, die das bestimmt zu sein, bevor die Gesamtzellkultur Zusammenbruch aufgetreten Zeitpunkt war extrahiert. Die Zellen wurden auch Fluoreszenzfärbung unterzogen und unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um virale Aktivität auf F-Actin-Bindung und Kerne Integrität zu untersuchen. Das Fazit dieser Studie ist, dass H. vitripennis Zellen, die kultiviert und zur Massenproduktion von HoCV-01 auf einen geeigneten Pegel zur Herstellung eines Biopestizids ermöglichen.

Zellwachstums wurde innerhalb von 48 h Durchgang in kleinen und großen Kulturflaschen aus Primärkulturen und setzte Passagen gesehen. Fibroblasten-Wachstum und die Entwicklung wurde auch innerhalb dieses Zeitrahmens beobachtet. Wenn neu ausgesät Kolben wurden vor 48 Stunden gestört, gab es eine sichtbare Rückgang der Zellhaftung, was zu langsameren wachsenden Kulturen und manchmal keine Bindung oder das Wachstum überhaupt. Zellen wurden etwa 80% konfluente innerhalb einer Woche nach der Übergabe und eine Monoschi...

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Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Homalodisca vitripennis Zellen und HoCV-1 in vitro zu propagieren. Medium wurde von HoCV-1-positiven Kulturen entfernt und RNA extrahiert alle 24 h für 168 Stunden. Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Färbung quantifiziert. Gesamtvirus-Partikel wurden nach der Infektion extrahiert. Extrahierte RNA wurde durch qRT-PCR quantifiziert.

Ausbreitung von<em&gt; Homalodisca coagulata Virus-01</em&gt; Über<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Zellkultur

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

11.6K Aufrufe.  University of Texas at Tyler.  Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Homalodisca vitripennis Zellen und HoCV-1 in vitro zu propagieren. Medium wurde von HoCV-1-positiven Kulturen entfernt und RNA extrahiert alle 24 h für 168 Stunden. Zelllebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Färbung quantifiziert. Gesamtvirus-Partikel wurden nach der Infektion extrahiert. Extrahierte RNA wurde durch qRT-PCR quantifiziert. 

Serie: Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. Three cellular sources have been used: Embryonic stem cells (ESC), induced pluripotent stem cells (iPSC) or adult stem cells. Here, culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described and used for infection with the gastric pathogen Helicobacter pylori. Human gastric glands are isolated from resection material, seeded in a basement matrix and embedded in medium containing growth factors epidermal growth factor (EGF), R-spondin, Noggin, Wnt, fibroblast growth factor (FGF) 10, gastrin and transforming growth factor (TGF) beta inhibitor. In these conditions, gastric glands grow into 3-dimensional organoids containing 4 lineages of the stomach. The organoids expand indefinitely and can be frozen and thawed similarly as cell lines. For infection studies, bacteria are microinjected into the lumen of the organoids. Infected organoids are processed for imaging. The described methods can be adapted to other organoids and infections with other bacteria, viruses or parasites. This allows the study of infection-induced changes in primary cells.

Stem cell derived cultures harbor tremendous potential to model infectious diseases. Here, the culture of mouse and human gastric organoids derived from adult stem cells is described. The organoids are microinjected with the gastric pathogen Helicobacter pylori.

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseum-Bindungsassay, der die Drug Penetration in Tuberkulose-Läsionen vorhersagt

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

Identifikation von Mediatoren der T-Zell-Rezeptor Signalgebung über das Screening von chemischen Inhibitors Bibliotheken

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for understanding the function of bacterial cells in the natural environment. Because of technological advances, various bacterial cell functions can be revealed at the single-cell level inside a confined space. GVs are spherical micro-sized compartments composed of amphiphilic lipid molecules and can hold various materials, including cells. In this study, a single bacterial cell was encapsulated into 10&#8211;30 &#956;m GVs by the droplet transfer method and the GVs containing bacterial cells were immobilized on a supported membrane on a glass substrate. Our method is useful for observing the real-time growth of single bacteria inside GVs. We cultured Escherichia coli (E. coli) cells as a model inside GVs, but this method can be adapted to other cell types. Our method can be used in the science and industrial fields of microbiology, biology, biotechnology, and synthetic biology.

We demonstrate single-cell culture of bacteria inside giant vesicles (GVs). GVs containing bacterial cells were prepared by the droplet transfer method and were immobilized on a supported membrane on a glass substrate for direct observation of bacterial growth. This approach may also be adaptable to other cells.

Bakterielle Zellkultur auf der Einzelzellebene im Riesenvesikel

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

Reinigung von hochertragreichen extrazellulären Vesikelpräparaten weg vom Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

Messung der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit, Distensibilität und Dehnung in einem Abdominal Aortenaneurysm Mausmodell

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

Visualisierung des Makrophagen-Lytic Zelltodes während der mykobakteriellen Infektion bei Zebrafischembryonen mittels Intravital-Mikroskopie

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Untersuchung der Aortenklappenverkalkung durch Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten unter Verwendung von Feederzellen aus bestrahltem Buffy-Fell

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...