Genaue quantitative Messungen von Proteinen sind entscheidend, um die dynamische und räumliche Zusammenarbeit zwischen Proteinen zu verstehen, um die Krankheit zurück in die Biologie zu verstehen. Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, einen integrierten quantitativen Proteomik-Workflow für Gewebeproben bereitzustellen, der markierungsfreies und markierungsbasiertes Proteinprofiling für die Biomarker-Entdeckung kombiniert. In dieser Studie haben wir das Instrument Orbitrap Fusion verwendet, um die Proteine mit markierungsbasierten und markierungsfreien Ansätzen zu quantifizieren.
Die Gewebelyse ist einer der wichtigsten Schritte für den Erfolg eines LC-MS-MS-Experiments. Nehmen Sie 30 mg Gewebe in einem Perlenschlagröhrchen. Nach dem Waschen mit dem PBS 300 Mikroliter Harnstofflysepuffer mit acht molaren Harnstoff, Tris, NaCl und MgCl2 hinzufügen.
Mit einem Sondenschallator wird der Inhalt des Gewebes lysiert. Wiederholen Sie dies für einen weiteren Zyklus. Wenn Sie intaktes Gewebe am Boden der Röhre beobachten, fügen Sie Zirkoniumperlen in die Röhre hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe mit einem Perlenschläger für 90 Sekunden, mit fünf Minuten Inkubation auf Eis.
Zentrifugieren Sie die Proben 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius um 6000 G, um die Zellreste vom Überstand zu trennen. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen Röhrchen und mischen Sie die Lösung gleichmäßig. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration im Gewebelysat mit Bradford-Reagenz.
Messen Sie dazu den OD der Probe bei 595 Nanometer und extrapolieren Sie ihn mit einem Standarddiagramm, wie auf diesem Bildschirm gezeigt. Nach der Proteinquantifizierung lassen Sie 10 Mikrogramm Gewebelysat auf 12% SDS-PAGE-Gel laufen, um die Qualität der Lysate zu überprüfen. Der erste Schritt bei der Aufschluss in Lösung beinhaltet die Reduzierung von Disulfidbindungen mit TCEP.
Nach der Zugabe von TCEP den Inhalt der Tube für eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Der nächste Schritt beinhaltet die Alkylierung, um zu verhindern, dass sich die reduzierten Disulfidbindungen neu bilden. Fügen Sie ein Alkylierungsmittel wie Jodacetamid hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang im Dunkeln.
Senken Sie nach der Inkubation die Endkonzentration von Harnstoff auf weniger als ein Mol, indem Sie mit vier bis acht Volumina Verdünnungspuffer verdünnen. An dieser Stelle ist es ratsam, den pH-Wert zu überprüfen. Der nächste Schritt beinhaltet die Zugabe von Trypsin zum Röhrchen und die Inkubation des Röhrchens über Nacht für eine effiziente Verdauung.
Am nächsten Tag trocknen Sie die verdauten Peptide in einem Vakuumkonzentrator ab und fahren mit dem Entsalzungsschritt fort. Um die Entsalzung von Peptiden durchzuführen, verwenden Sie C18-Stufenspitzen. Aktivieren Sie die C18-Stufenspitze, indem Sie 50 Mikroliter Methanol hinzufügen, zentrifugieren Sie die Spitze zwei Minuten lang bei 1000 G.
Fügen Sie nun 50 Mikroliter Acetonitril in 0,1% Ameisensäure hinzu, um die Bühnenspitze zu waschen, und zentrifugieren Sie die Spitze erneut. Rekonstituieren Sie die getrockneten verdauten Peptide in 50 Mikrolitern 0,1% Ameisensäure. Fügen Sie die rekonstituierten Peptide in die aktivierte Stadiumspitze hinzu.
Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens viermal. Um die Probe zu waschen, fügen Sie 50 Mikroliter 0,1% Ameisensäure hinzu und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Für die Elution von Peptiden fügen Sie 50 Mikroliter 40% ACN in 0,1% Ameisensäure hinzu und führen Sie es durch Zentrifugation durch die Stufenspitze.
Wiederholen Sie diesen Schritt mit 50% und 60% ACN in 0,1% Ameisensäure und sammeln Sie das Filtrat in einem frischen Röhrchen. Trocknen Sie die entsalzten Peptide mit einem Vakuumkonzentrator. Quantifizieren Sie vor dem LC-MS-Lauf die Peptide mit der Scopes-Methode.
Laden Sie dazu zwei Mikroliter rekonstituierter Probe in den Brunnen einer Mikrotropfenplatte und messen Sie die Absorption bei 205 Nanometern und 280 Nanometern. Berechnen Sie die Konzentration aus der auf dieser Folie beschriebenen Formel. Sobald die entsalzten Peptide getrocknet sind, sind sie bereit für die markierungsbasierte Quantifizierung.
Für die iTRAQ-Markierung müssen die getrockneten Peptide in 20 Mikroliter Auflösungspuffer rekonstituiert werden, der im iTRAQ-Markierungskit enthalten ist. Rekonstituieren Sie die Etiketten, indem Sie Ethanol aus der im Kit enthaltenen Durchstechflasche hinzufügen und gründlich mischen. Es ist ratsam, dass alle Schritte gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden.
Fügen Sie die homogen gemischten iTRAQ-Etiketten zu ihren jeweiligen Röhrchen hinzu und lassen Sie die Markierungsreaktion stattfinden. Am Ende der Reaktion löschen Sie überschüssiges ungebundenes Etikett in der Tube durch Zugabe von MS-Wasser und inkubieren Sie es für eine halbe Stunde bis eine Stunde. Nun den gesamten markierten Inhalt in eine einzige Tube geben und die markierten Peptide trocknen.
Nachdem Sie die Proben in 0,1% Ameisensäure rekonstituiert haben, öffnen Sie den Autosampler von NanoLC und legen Sie die Proben in den Autosampler. Nachdem die Proben in den Autosampler gelegt wurden, ist es wichtig, die richtigen Parameter für die Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie einzustellen. Hier beschreiben wir die Parameter sowohl für die markierungsfreie Quantifizierung als auch für die iTRAQ-basierte Quantifizierung mittels LC-MS.
Im Falle einer markierungsfreien Quantifizierung wurde ein Gradient von 120 Minuten verwendet, da eine einzelne unfraktionierte Probe injiziert wird. Diese Dauer kann je nach Probenkomplexität erhöht oder verringert werden. In diesem Experiment wurde ein Fluss von 300 Nanolitern pro Minute mit dem folgenden Gradienten für Lösung B eingestellt, der in diesem Fall 80% Acetonitril in 1% Ameisensäure ist.
Auf die gleiche Weise können wir einen Gradienten für ein iTRAQ-Experiment festlegen. Da die Proben nicht verletzt sind, wurde ein 90-minütiger Gradient verwendet. Die MS-Parameter sowohl für die markierungsfreie Quantifizierung als auch für die iTRAQ-markierungsbasierte Quantifizierung können hier eingesehen werden.
Der erste Schritt besteht darin, den Anwendungsmodus durch Klicken auf die globalen Parameter einzustellen. Wählen Sie den Peptidmodus aus und legen Sie die Methodendauer gemäß dem verwendeten LC-Gradienten fest. Definieren Sie die Scanparameter für das Experiment.
Wenn Sie auf die Option MS-OT klicken, werden die Parameter sichtbar. Der verwendete Detektortyp ist auf Orbitrap festgelegt. Die andere Option, die auf diesem Instrument verfügbar ist, beinhaltet eine Ionenfalle.
Die Auflösung wurde auf 60.000 eingestellt, und man kann je nach Bedarf und Art des Experiments zwischen verschiedenen verfügbaren Optionen wählen. Der Massenbereich ist normal, und der Scanbereich ist von 375 bis 1700 eingestellt. Die anderen Parameter sind Standard für MS Application.
Die Intensitätsschwelle wurde festgelegt und der Ladezustand im Bereich von zwei bis sechs festgelegt. Der dynamische Ausschluss wurde auf 40 Sekunden festgelegt, und die Massentoleranz wurde auf 10 gehalten. Der nächste Parametersatz enthält die MS-MS-Parameter.
Der Isolationsmodus wurde mit Quadrupol ausgewählt, das Isolationsfenster auf zwei gesetzt, der Isolationsversatz wurde deaktiviert und der Aktivierungstyp ist normalerweise HCD für das Proteomik-Experiment. Die Kollisionsenergie kann entweder fixiert oder unterstützt werden. Markierte Proben benötigen höhere Kollisionsenergien, daher ist es für iTRAQ-Experimente ratsam, die Kollisionsenergie auf 35 einzustellen, während sie für LFQ-Experimente auf 30 eingestellt werden kann.
Der hier verwendete Detektortyp ist Orbitrap. Der Scanbereichsmodus ist automatisch. Die anderen Parameter sind Standard für iTRAQ-Experimente und markierungsfreie quantitative Experimente.
Ein Klick auf die Zusammenfassung gibt einen Überblick über alle LC- und MS-Parameter, die für das Experiment verwendet wurden. Sie können sich jeden einzelnen Parameter ansehen und das Korrekturlesen durchführen. Sobald dies erledigt ist, klicken Sie auf die Datei und speichern Sie sie als Methodendatei.
Sobald Sie gespeichert haben, können Sie die Methode ausführen, und Sie erhalten die Rohdateien. Und dann können diese Rohdateien mit der Proteome Discoverer-Software analysiert werden. Diese Abbildung zeigt die Sequenzabdeckung von BSA in drei technischen Replikaten, die in den drei Replikaten 91% beträgt.
Dies gibt die Reproduzierbarkeit des Instruments an. Diese Abbildung zeigt nun die Gleichmäßigkeit der Anzahl der Peptidspektralabgleiche, Peptide und Proteine, die in drei verschiedenen biologischen Proben identifiziert wurden, was wiederum eine Vorstellung von der Reproduzierbarkeit des Instruments gibt. Hier stellt das Venn-Diagramm die gemeinsamen und exklusiven Proteine dar, die in drei verschiedenen Proben in markierungsfreien Experimenten und markierungsbasierten Experimenten identifiziert wurden.
Diese Balkendiagramme zeigen die Anzahl der Peptidspektralübereinstimmungen, Peptidgruppen, Gesamtproteine, Proteingruppen und Proteinanzahl nach 1% FDR, die im LFQ- und iTRAQ-Experiment identifiziert wurden. Die Gewebeproteomik biologischer Proben ermöglicht es uns, neue potenzielle Biomarker zu erforschen, die mit verschiedenen Stadien des Krankheitsverlaufs verbunden sind. Das beschriebene Protokoll für die quantitative Proteomanalyse von Gewebe liefert reproduzierbare gute Abdeckungsdaten.
Der Einsatz von technischen Replikaten gewährleistet eine gute Reproduzierbarkeit, auch wenn die Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten ausgeführt werden. Hier haben wir die Analyse von Gewebeproben mit zwei Quantifizierungsmethoden gezeigt: markierungsfreie und markierungsbasierte Proteomik. Die Auswahl quantitativer proteomischer Techniken kann von der Anzahl der Proben, der Verfügbarkeit von MS-Plattformen und der zu behandelnden biologischen Frage abhängen.
