Gezielte proteomische Ansätze werden schnell zur Methode der Wahl für die Validierung von Proteinen aus kurzfristigen Proteomik-basierten Experimenten oder aus molekularbiologischen Experimenten. Die Überwachung mehrerer Reaktionen ist ein solcher gezielter Ansatz, der zunehmend zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinen aus biologischen Proben eingesetzt wird. In dieser Studie haben wir die verschiedenen Schritte zum Nachweis und zur Quantifizierung von Proteinen aus menschlichem Hirngewebe durchlaufen, um die Leser in die grundlegenden Anforderungen eines MRM-Experiments einzuführen.
Wiegen Sie etwa 50 mg Hirngewebe und waschen Sie das Gewebe mit 300 Mikrolitern 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Dieser Schritt wird durchgeführt, um Blut auf der äußeren Oberfläche des Gewebes zu entfernen, und daher ist es ratsam, so viel Blut wie möglich zu entfernen. Nach dem Waschen mit PBS 300 Mikroliter Lysepuffer in das Röhrchen geben, das das Gewebe enthält.
Lyse das Gewebe mit einem Sondenschallator, während sie den Schlauch auf einem Eisbad halten. Fahren Sie mit der Gewebehomogenisierung mit einem Perlenschläger fort, um das Gewebe vollständig zu lysieren. Zentrifugieren Sie den Inhalt des Röhrchens bei 6000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Den Überstand in ein frisches Röhrchen geben und homogen mischen. Nehmen Sie ein kleines Aliquot des Überstands und quantifizieren Sie den Proteingehalt mit einem Standardproteinassay. Hier zeigen wir ein Beispiel für die Proteinschätzung mit Bradford Assay.
Nehmen Sie 50 Mikrogramm Protein in einem Mikrozentrifugenröhrchen und reduzieren Sie den Inhalt durch Zugabe von TCEP, so dass die Endkonzentration 20 Millimolar beträgt. Inkubieren Sie den Inhalt bei 37 Grad für eine Stunde. Nach der Inkubation alkylieren Sie die reduzierten Proteine durch Zugabe von Jodoacetamid in das Röhrchen, so dass die Endkonzentration 40 Millimolar beträgt.
Inkubieren Sie die Tube 30 Minuten lang im Dunkeln. Fügen Sie nun Puffer B zu dem Röhrchen hinzu, das die reduzierten und alkylierten Proteine enthält, so dass die Endkonzentration von Harnstoff weniger als einen Molar beträgt. Fügen Sie Trypsin in 1 bis 30 Enzym-protein-Verhältnis hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen über Nacht bei 37 Grad unter ständigem Schütteln.
Nach der Verdauung die verdauten Peptide in einem Vakuumkonzentrator konzentrieren. In diesem Schritt können die Peptide entweder rekonstituiert und entsalzt oder bei minus 80 für die zukünftige Verwendung gespeichert werden. Die Entsalzung oder Peptidreinigung ist vor dem Laden der Proben auf eine LC-MS MS unerlässlich. Salze und andere Verunreinigungen in der Probe können die Säule verstopfen und die Empfindlichkeit des Instruments auf lange Sicht beeinträchtigen.
Dieser Vorgang kann mit handelsüblichen C18 STAGE-Spitzen oder -Säulen durchgeführt werden. Hier haben wir den Workflow für die Peptidentsalzung mit einer C18 STAGE Spitze dargestellt. Nach dem Entsalzen trocknen Sie die Peptide in einem Vakuumkonzentrator.
Rekonstituieren Sie diese sauberen Peptide und fahren Sie mit der Scopes-Methode zur Quantifizierung fort. Laden Sie dazu zwei Mikroliter der Probe in eine Mikrotropfenplatte und berechnen Sie die Konzentration wie im Objektträger gezeigt. Die Vorbereitung der Übergangsliste ist ein entscheidender Schritt in einem SRM- oder MRM-Experiment.
Eine Übergangsliste enthält alle Informationen, die das Massenspektrometer benötigt, um den Übergang zu überwachen. Dazu gehören die m x z-Werte der Vorläufer- und Produktionen, die Kollisionsenergie des Übergangs, die Polarität des Instruments und der Zeitbereich für die Datenerfassung. Bereiten Sie die Übergangsliste mit Skyline vor.
Bereiten Sie ein Hintergrundproteom mit der Human Proteome Fasta-Datei von UniProt vor und stellen Sie sicher, dass es auf der Registerkarte Hintergrund der Peptideinstellungen ausgewählt ist. Legen Sie auf der Registerkarte Filter eine Mindestlänge von 8 und eine maximale Länge von 25 fest. Verwenden Sie weiterhin die Standardeinstellungen, wenn keine anderen Änderungen an den Peptiden vorgenommen werden.
Sobald die Peptideinstellungen vorgenommen wurden, klicken Sie auf Übergangseinstellungen. Legen Sie auf der Registerkarte Filter die Vorproduktgebühren auf 2 und 3 fest. Legen Sie Ionenladungen auf 1 und Ionentypen auf y fest.
Produktionen können je nach Wahl des Benutzers ausgewählt werden. Lassen Sie alle Parameter als Standard. Fügen Sie nun die Beitritts-IDs der ausgewählten Zielproteine ein.
Dies kann durch Klicken auf die Registerkarte Bearbeiten, dann einfügen und schließlich die Beitritts-IDs einfügen. Die IDs werden den Proteinen im Hintergrundproteom zugeordnet und eine Übergangsliste basierend auf den zuvor festgelegten Peptid- und Übergangseinstellungen erstellt. Exportieren Sie diese Übergangsliste.
Stellen Sie sicher, dass das richtige Instrument ausgewählt ist, indem Sie auf die Dropdown-Option Gerätetyp klicken. In diesem Fall ist das Instrument Thermo Altis. Da die undefinierte Übergangsliste zu viele Übergänge enthält, sollten Sie ein Limit von nur 350 Übergängen pro Liste beibehalten und als mehrere Methoden exportieren.
Es wird ein binäres Lösungsmittelsystem verwendet. Lösungsmittel A ist 1% FA und Lösungsmittel B ist 80% ACN. Halten Sie die Durchflussrate bei 450 Mikroliter pro Minute und den Gradienten wie gezeigt.
Stellen Sie die Temperatur des Säulenfachs auf 45 Grad Celsius ein. Weitere Informationen zu Spalte und LC-System finden Sie im Text. Stellen Sie sicher, dass die MS-Einstellungen in Ihrem TSQ Altis wie hier gezeigt sind.
Importieren Sie eine einzelne Übergangsliste, um eine neue Methode zu erstellen. Wir empfehlen, die Auflösung für Quadrupol 1 und Quadrupol 3 bei 7 zu fassen. Diese können bei Bedarf weiter optimiert werden.
Um die Konsistenz der Läufe und damit die Datenqualität zu gewährleisten, bereiten Sie Ihre Ausführungssequenz wie gezeigt vor. Beginnen Sie mit ein paar Leerzeichen, beziehen Sie sich auf den Text für die Zusammensetzung der Leerenmischung, gefolgt von einem QC-Standardlicht BSA mit bekannter Konzentration, um jede Variation der tagesweisen Reaktion des Instruments zu überwachen. Die QC sollte kurz vor den Proben erfolgen.
Als nächstes reihen Sie alle Samples mit Leerzeichen dazwischen an. Injizieren Sie gleiche Mengen jeder Probe, wobei 25 bis 1 Nanogramm Peptide pro Injektion berücksichtigt werden. Um eine verfeinerte Methode zu erstellen, führen Sie zuerst die undefinierten Methoden für ganze Stichproben aus.
Importieren Sie die Ergebnisse in Skyline und überprüfen Sie jedes Peptid manuell. Wählen Sie für jedes Peptid einen Vorläufer aus, der in allen Proben konstant gute Peaks aufzeigt. Löschen Sie Vorläufer und Peptide, die keine guten Spitzen zeigen.
Stellen Sie sicher, dass alle Spitzen ordnungsgemäß mit Anmerkungen versehen sind. Um den richtigen Peak auszuwählen und die Übergänge unter jedem Precursor weiter zu verfeinern, kann eine Bibliothek verwendet werden. Eine Bibliothek ist ein Satz von MS-MS-Spektraldaten, die mit Peptiden und Übergängen der aktuellen experimentellen Daten abgeglichen werden.
Wählen Sie Spitzen aus, deren DART P-Werte näher an 1 liegen, und entfernen Sie Übergänge, die nicht mit der Bibliothek übereinstimmen. Ein DART P-Wert gibt an, wie gut die Übereinstimmung zwischen dem experimentellen Peak und dem Library Peak ist. Nach ein oder zwei Optimierungsrunden steht eine verfeinerte Liste bereit.
Diese verfeinerte Liste kann für einzelne Proben ausgeführt werden. Importieren Sie die verfeinerten Läufe in Skyline und kommentieren Sie Peaks richtig. Verwenden Sie die Registerkarte Anmerkung unter Dokumenteinstellungen, um jedes Beispiel im Dokumentraster sorgfältig zu kommentieren.
Verwenden Sie die Gruppenvergleichsfunktion, um Vergleiche zwischen Bedingung 1 und Bedingung 2 des Experiments zu erstellen. Dadurch erhalten Sie eine Tabelle mit angepassten P-Werten und Faltenänderungswerte zwischen den beiden Gruppen. Unseres Wissens ist dies die erste Studie, die die Verwendung von MRM verwendet, um Peptide für die Proteine Apolipoprotein A-1, Vimentin und Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase in menschlichen Hirngewebeproben nachzuweisen.
Die Optimierung verschiedener Parameter wie LC-Gradient, Verweilzeit, Zykluszeit und Kollisionsenergie kann den Erfolg eines MRM-Experiments stark beeinflussen. Wir glauben, dass diese Technik verwendet werden kann, um Muster von Biomarkern zu entwickeln, die in der Lage sind, zwischen verschiedenen klinischen Zuständen und Krankheiten zu unterscheiden.
