Diese Methode wird verwendet, um Zapfenrezeptoren zu untersuchen, die für das Tageslichtsehen unerlässlich sind. Der Vorteil der Methoden ist, dass sie befruchtete Hühnereier verwenden, die leicht zugänglich sind und eine der einzigen Quellen für primäre Zapfenkulturen sind. Das Protokoll wurde verwendet, um den Rod-Derived Cone Viability Factor zu identifizieren, eine zukunftsfähige vielversprechende Behandlung für vererbte Netzhautdegeneration.
Darüber hinaus wurde das Protokoll verwendet, um den Metabolismus von Zapfenphotorezeptoren zu untersuchen. Durch sorgfältige Befolgung des beschriebenen Protokolls sollte eine Person, deren Expertise in der primären Zellkultur liegt, in der Lage sein, nach nur wenigen Versuchen eine mit Zapfen angereicherte Kultur zu erhalten. Beginnen Sie mit dem Sammeln von wöchentlich befruchteten Eiern aus einer industriellen Brüterei.
Halten Sie die befruchteten Eier bei 17 Grad Celsius im Labor. Für jede Kultur sieben befruchtete Eier für 24 Stunden bei 20 Grad Celsius und dann 136 Stunden bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer mit intermittierender Neigungsumkehr bebrüten. Um die Hühnerembryonen zu bergen, waschen Sie die Oberfläche der Eier mit Desinfektionsmittel, brechen Sie die Eierschale, indem Sie mit einer großen geraden Zange ein Loch an der Oberseite der Schale machen, und schneiden Sie dann die Schale, um den Hut aus dem Ei zu entfernen.
Extrahieren Sie vorsichtig jeden Embryo aus der Eierschale mit einer gekrümmten Zinnen und übertragen Sie ihn in eine Petrischale mit sterilem PBS, die zuvor auf 37 Grad Celsius erhitzt wurde. Entfernen Sie vorsichtig die Hülle, die die Embryonen umgibt. Überprüfen Sie das Entwicklungsstadium jedes Embryos durch visuellen Vergleich mit Hamburger und Hamilton und wählen Sie zwei Embryonen im 29. Entwicklungsstadium aus Enukleieren Sie die Augen dieser ausgewählten Embryonen und übertragen Sie sie in ein kohlendioxidunabhängiges Medium.
Arbeiten Sie in einem kohlendioxidunabhängigen Medium und positionieren Sie vier Augen mit der Hornhaut nach unten und dem Sehnerv zum Experimentator. Bohren Sie mit zwei geraden Zetten ein Loch in den Sehnerv. Führen Sie einen Ast jeder Zette zwischen die Netzhaut und das Pigmentepithel ein, ziehen und drehen Sie dann das Auge, um das Epithel von der Netzhaut zu lösen.
Entfernen Sie die Hornhaut, gefolgt von der Linse und dem Glaskörper. Die vier Netzhäute werden in eine Petrischale mit Ringers Medium bei pH 7,2 überführen. Schneiden Sie die vier Netzhäute mit zwei geraden Zangen in sehr kleine Stücke und waschen Sie die Stücke zweimal mit Ringers Medium.
Nach dem zweiten Waschen lassen Sie die Netzhautstücke auf den Boden des Röhrchens fallen und entfernen Sie das Medium. Behandeln Sie die Netzhautstücke mit einer Lösung von Trypsin für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius. Stoppen Sie nach 20 Minuten die Reaktion, indem Sie Nährmedien hinzufügen, die mit 10% inaktiviertem fetalem Kalbserum ergänzt sind.
Inkubieren Sie die Zellsuspension mit 0,05 mg DNase 1 Dann dissoziieren Sie sofort die Zellcluster und die DNA, indem Sie mit einer Pipette auf und ab pipettieren. Waschen Sie die Netzhautzellsuspension zweimal mit chemisch definiertem Kulturmedium oder CDM. Zwei schwarze 96-Well-Kulturplatten mit transparentem Boden zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit Polylysin behandeln.
Wenn Sie fertig sind, spülen Sie die Platten zweimal mit dem M199-Kulturmedium aus. Fügen Sie Trypanblau zu einem Aliquot von 10 Mikrolitern der Zellsuspension hinzu, um die lebenden Zellen zu färben. Dann fügen Sie die Zellsuspensionsprobe zu einem Hämozytometer hinzu.
Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, bringen Sie die Zellsuspension mit CDM auf die entsprechenden Konzentrationen. Fügen Sie 50 Mikroliter der Bibliothek der Moleküle hinzu, die mit einem vordefinierten Muster gescreent werden sollen. Die 50 Mikroliter der beiden Zellsuspensionen in die beiden vorbehandelten schwarzen 96-Well-Kulturplatten einsäen.
Verteilen Sie die Zellen in den Platten mit einer Mehrkanalpipette von rechts auf der Platte nach links und homogenisieren Sie zwischen jeder Säule. Dann inkubieren Sie die Platten sieben Tage lang bei 37 Grad Celsius, unter 5% Kohlendioxid ohne Medienwechsel. Um die lebensfähigen Zellen zu zählen, fügen Sie 2,7 mikromolare Calcein AM und 0,3 Millimolarethidiumhodimer zu jeder Vertiefung der Platte hinzu.
Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur in Abwesenheit von Licht. Lesen Sie die Fluoreszenz auf einem automatisierten Plattenleser, der aus einem invertierten Mikroskop besteht, das mit einer Quecksilberlampe mit zwei Anregungsfiltern bei 485 und 520 Nanometern, zwei Emissionsfiltern bei 520 und 635 Nanometern und einer ladungsgekoppelten Gerätekamera ausgestattet ist. Dieses Protokoll wurde verwendet, um eine normalisierte cDNA-Bibliothek aus Aderhaut- und Netzhautpigmentepithel aus 400 Augen eines acht Wochen alten Long-Evans-Ratten zu screenen.
Insgesamt wurden 2.112 Sätze von 100 Klonen entsprechend 211.200 einzelnen Klonen ausgewertet. Unter den 42 Pools von Klonen mit einem Verhältnis von mehr als zwei hatten die Pools 0080 und 0073 ein Lebensfähigkeitsverhältnis, das 16 und 14-mal höher war als die Negativkontrolle nach sieben Tagen Kultur. Jeder ausgewählte von 100 Klonen wurde in 16 Sätze von 10 Klonen aus ihrem Glycerinbestand unterteilt.
Der Subpool 0073-09 ergab das stärkste Lebensfähigkeitsverhältnis und wurde unterteilt, um 16 einzelne Klone zu produzieren, die in einer dritten Runde des Screenings an kegelangereicherten Kulturen getestet wurden. Der Klon 0073-09-37 zeichnete sich durch ein Lebensfähigkeitsverhältnis von 2,5 aus. Weitere Analysen bestätigten, dass dieser Klon eine robuste und reproduzierbare Wirkung auf das Überleben des Kegels hat.
Der Test wurde unabhängig voneinander wiederholt und der Einsatz von 1,8 Kilobasen sequenziert. Eine bioinformatische Analyse ergab, dass der Klon 0073-09-37, der als Epithel-Derived Cone Viability Factor oder EdCVF bezeichnet wurde, drei offene Leserahmen enthält. Bei unabhängiger Prüfung übte nur ORF1 eine schützende Wirkung auf die Zapfen aus.
ORF1 wurde als Glutathion-S-Transferase-Protein hergestellt. Der aus Epithel gewonnene Zapfenlebensfähigkeitsfaktor wurde gereinigt und das GST-Tag entfernt. Die Analyse der trophischen Aktivität zeigte, dass EdCVF in der Lage ist, die Degeneration von Zapfen im kegelangereicherten Kultursystem zu verhindern.
Bei diesem Verfahren sollte das Entwicklungsstadium der Embryonen sorgfältig überprüft werden, um die mit dem Kegel angereicherten Kulturen zu erhalten. Nach diesem Protokoll können die Zellen mit Plasmid-DNA elektroporiert werden, um die molekularen Mechanismen von Überlebensfaktoren wie RdCVF zu untersuchen. Diese Technik ebnet die Stoffwechselforschung einschließlich der Entwicklung mathematischer Modelle des Kegelüberlebens.
