Name: assays for the degradation of misfolded proteins in cells
Uploaded: 2016-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
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We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).

1. Herstellung von Reagent <ol><li> Bereiten Zelllyse - Puffer (50 mM Tris, pH 8,8, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 0,5% NP-40). Ergänzung 2 mM DTT, 1x vollständige Protease-Cocktail, und 250 IU / ml Benzonase vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Pelletpuffer (20 mM Tris, pH 8,0, 15 mM MgCl 2). Ergänzung 2 mM DTT, 1x vollständige Protease-Cocktail und 250 IU / ml Benzonase vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten 3x siedende Puffer (6% SDS, 20 mM Tris, pH 8,0). Supplement 150 mM DTT vor dem Gebrauch. </li><li> Bereiten Sie Low-Fluoreszenz DMEM-Medium für Tests unter Verwendung von Mikrotiterplatten-Fluoreszenzreader. Mischungs 25 mM Glucose, 0,4 mM Glycin, 0,4 mM Arginin, 0,2 mM Cystein, 4,0 mM Glutamin, 0,2 mM Histidin, 0,8 mM Isoleucin, 0,8 mM Leucin, 0,8 mM Lysin, 0,2 mM Methionin, 0,4 mM Phenylalanin, 0,4 mM Serin, 0,8 mM Threonin, Tryptophan 0,078 mM, 0,4 mM Tyrosin, 0,8 mM Valin, 1,8 mM CaCl 2, 0,81 mM MgSO 4, 5,33 mM KCl, 44,0 mM NaHCO 3, 110 mM NaCl, 0,9 mMNaH 2 PO 4. Der pH-Wert der Lösung mit HCl oder NaOH auf pH 7,4. Sterilisieren des Mediums durch Filtration. Hinweis: Dieses Medium enthält Komponenten des Standard - DMEM - Medium mit hohem Glucosegehalt , außer dass Fe (NO 3) 3, Vitamine und Phenolrot weggelassen. Phenolrot, Riboflavin und Pyridoxal in regelmäßigen DMEM - Kulturmedium mit der Detektion von Fluoreszenzsignal 21 erheblich stören. Das Kulturmedium ohne diese Komponenten ist entscheidend für eine erfolgreiche Live-Cell-GFP-Bildgebung. Das Medium ist stabil für 12 Monate bei gekühlter Lagerung. </li></ol> 2. Der Abbau Assay von ATXN1 82Q GFP <ol><li> Platte etwa 3 x 10 5 HeLa - Zellen in 35 mm - Platten mit DMEM - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, so daß nach O / N Kultivieren von Zellen auf eine Konfluenz von 40-60% zum Zeitpunkt der Transfektion wachsen. HINWEIS: Die Anzahl von Platten benötigt wird, basierend auf der Anzahl von Zeitpunkten und Behandlungen dunter escribed. </li><li> Transfizieren HeLa - Zellen mit 0,3 &amp; mgr; g ATXN1 82Q-GFP / pRK5 Plasmids in jede Vertiefung Reagenz Transfektion Herstelleranweisung gemäß 9. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz und Aliquotierung es für jeden gut. </li><li> 4-5 Stunden nach der Transfektion, untersuchen Sie die lebenden Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm. Rück Zellen zurück zu Inkubator nach der Bebilderung. Hinweis: Beachten Sie die beiden diffuses GFP-Signale und kleine Sprenkel von GFP-Signale in Kern zu diesem Zeitpunkt. </li><li> Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und 2 ml frisches DMEM, das 50 ug / ml CHX. Behandlung von Zellen für 0, 4, 8, 12 und 16 h mit CHX vor der Ernte. Um den proteasomalen Abbau, sind Proteasom-Inhibitor MG132 (10 &amp; mgr; M) in einer Platte behandelt für 16 Stunden als Kontrolle untersuchen. </li><li> Ernten Sie eine Platte von Zellen zu jedem Zeitpunkt. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung eind die Platten zweimal mit 3 ml eiskaltem 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) waschen. Snap-gefrieren die Platte auf Trockeneis. </li><li> Nach dem letzten Zeitpunkt (16 Stunden), kratzen die gefrorenen Zellen (aus allen Zeitpunkten) in 150 ul eiskaltem Puffer Zelllyse und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. </li><li> Zentrifugieren der Zelllysate in einer Tischzentrifuge bei 17.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Den Überstand, die NP-40-löslichen (NS) Proteine ​​enthält, in ein anderes Röhrchen mit einer Pipette. HINWEIS: Stände Verwendung für Proteinkonzentrationen von Bradford-Test messen, wenn nötig. </li><li> Spülen Sie die Pellets durch sanft Zusatz von ca. 200 ul 1x PBS auf die Rohre, ohne die Pellets zu stören. Sorgfältig PBS durch Absaugung oder Pipette entfernen. Re-suspendieren sie in 150 ul eiskaltem Zellpelletpuffer, gefolgt von 15-30 min Inkubation auf Eis. HINWEIS: Die resuspendierte Pellet-Fraktion enthält NP-40 unlöslich (NI) Proteine. Siehe Abbildung 1B für eine diagWidder der Waschmittel-Fraktionierung. </li><li> In 75 ul 3x siedendem Puffer in NS-Fraktionen und NP-40 unlöslich (NI) Fraktionen, die aus den Pellets suspendiert. Erhitzen Sie die Proben bei 95 ° C auf einem Heizblock für 5 min. HINWEIS: Clumps in den NP-40 unlöslichen Fraktionen werden aufgelöst nach dem Erhitzen und Proben wird deutlich werden. </li><li> In SDS-Gelladepuffer auf eine aliquote Menge von gekochtem NS und NI. Laden gleichen Volumen von Proben aus allen Zeitpunkten auf SDS-PAGE-Gel aufgefangen. Die Volumen geladen entspricht etwa 20 &amp; mgr; g NS von der Probe zum Zeitpunkt 0 NOTE gesammelt: NS sowie SDS-löslichen (SS) Protein aus NI-Fraktion kann durch SDS Trenngel gelöst werden. Im Gegensatz dazu SDS-resistente (SR) Aggregate von NI Fraktion werden in den Gel - Befüllungs - Wells (1B) stecken. Zur Western-Blot-Erkennung, doppeltes Volumen von NI verbessern können geladen werden. </li><li> Erkennen NS und SS ATXN1 82Q-GFP durch Western-Blot unter Verwendung von anti-GFP-Antikörper und verstärkte Chemilumineszenz (ECL). HINWEIS: ATXN1 82Q in der SS-Fraktion wird in der Regel im Vergleich weniger auf die NS-Fraktion, wenn dieses Protokoll verwenden. Längere ECL Belichtung für optimale Signale benötigt. </li><li> Untersuchen SR ATXN1 82Q von der Pelletfraktion durch Filterverzögerungs Assays unter Verwendung eines Dot-Blot - Vorrichtung (1B). Kurz gesagt, stellen Sie eine 0,2 um Celluloseacetat-Membran eine Dot-Blot-Vorrichtung hält. Last 80-120 ul gekocht NI in jede Vertiefung der Dot-Blot-Apparatur. Hinweis: Da nur geringe Mengen an SR-Aggregate in den Zellen gebildet werden, für die Dot-Blot-Assay, laden ein Volumen des SR-Fraktion, die etwa 10-15 mal des Volumens des NS-Fraktion für Western-Blot-Analyse verwendet wird. <ol><li> Nach dem Filtrieren der Proben durch die Membran durch Vakuum, ATXN1 82Q-GFP - Aggregate auf der Membran stecken kann 9,12,22 von anti-GFP - Immunoblotting nachgewiesen werden. HINWEIS: Siehe vorherigen Berichte 9,12,22 für detaillierte Beschreibung der Filter Retardation - Assay. Dieser Schritt ist optionalweil SR ATXN1 82Q ist minimal im Vergleich zu SS und NS Fraktionen, die die kurze Transfektion in diesem Protokoll beschrieben folgen. Darüber hinaus bleiben die Ebenen der SR ATXN1 82Q weitgehend gleich über CHX chase (2B). Jedoch ist es immer noch von entscheidender Bedeutung zu prüfen, ob die Mengen von SS ATXN1 82Q sind im Laufe der Zeit beeinflusst für jede medikamentöse Behandlung oder Genexpression in anfänglichen Experimenten. SS Proteinspezies bleiben in SDS-PAGE-Gel Befüllungs-Wells kann durch Western-Blot nachgewiesen werden. Jedoch ist dieses Verfahren weniger empfindlich und erzeugt mehr variable Ergebnisse (1B). </li></ol></li></ol> 3. Degradation Assay von NLS-Luciferase-GFP unter Verwendung von SDS-PAGE und Western-Blot <ol><li> Platte etwa 3 x 10 5 HeLa - Zellen in 35 mm - Platten mit DMEM - Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Nach O / N Kultivierung eine Konfluenz von 40-60% zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen. Die Anzahl von Platten benötigt wird, von der Anzahl der t basierendime Punkte und Behandlungen im Folgenden beschrieben. </li><li> Transfizieren HeLa - Zellen mit 1,0 ug NLS-Luciferase-GFP / pRK5 Plasmid in jedes Well Reagenz Transfektion Herstelleranweisung gemäß 9. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz für aliquoten jeder Vertiefung. </li><li> Nach O / N-Transfektion (etwa 15 Stunden), die lebende Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm zu untersuchen. Rück Zellen zurück zu Inkubator nach der Bebilderung. HINWEIS: Diffuse Kern GFP-Signal kann in der Mehrzahl der Zellen (70%) beobachtet werden. Ein kleiner Anteil (5%) von Zellen haben Kern Aggregate. </li><li> Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und 2 ml frisches DMEM, das 50 ug / ml CHX. Behandeln Sie Zellen für 0, 1,5, 3, 4,5 und 6 Stunden mit CHX vor der Ernte. Um den proteasomalen Abbau, zusätzliche Proteasom-Inhibitor MG132 (10 &amp; mgr; M) in einer Platte behandelt 6 Stunden als Kontrolle untersuchen. </li><li> Ernten Sie eine Platte von Zellen zu jedem Zeitpunkt. Entfernen Sie das Medium durch Absaugung und waschen Sie die Platten zweimal mit 3 ml eiskaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS). Snap-gefrieren die Platte auf Trockeneis. </li><li> Nach dem letzten Zeitpunkt (6 Stunden) ist abgeschlossen, bei gefrorenen Zellen Allzeitpunkte werden für 30 min in 150 ul eiskaltem Zelllysepuffer und inkubiert auf Eis gekratzt. </li><li> Hinzufügen SDS-Gel-Ladepuffer zu Ganzzelllysaten für eine Endkonzentration von 2% SDS und 50 mM DTT. Inkubieren Proben auf einem Heizblock bei 95 ° C für 5 min. </li><li> Analysieren NLS-Luciferase-GFP durch SDS-PAGE und Western-Blot unter Verwendung von Anti-GFP-Antikörper. Laden gleichen Volumen von Proben aus allen Zeitpunkten auf SDS-PAGE-Gel aufgefangen. Das Volumen entspricht etwa 20 &amp; mgr; g Ganzzelllysaten von Probe bei der Zeit gesammelt 0 geladen. </li></ol> 4. Echtzeit-Abbau-Test der NLS-Luciferase-GFP mittels Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader <ol><li> Samen etwa 1 x 10 &amp; sup4 ;HeLa-Zellen in schwarz 96-Well-Gewebekulturplatten mit transparentem Boden. Nach O / N Kultivierung eine Konfluenz von 50-70% zum Zeitpunkt der Transfektion zu erreichen. HINWEIS: 60 ul Medium vollständig suspendiert HeLa-Zellen enthalten, werden direkt in jede Vertiefung ausgesät. Nicht zusätzliches Medium oder Steinplatte nach dem Aussäen hin und her hinzufügen, sonst können Zellen ungleichmäßig verteilt werden. </li><li> Transfizieren HeLa - Zellen mit 0,05-0,1 ug NLS-Luciferase-GFP / pRK5 Plasmid 9 in jede Vertiefung Reagenz Transfektion Herstelleranweisung entsprechend. Machen Sie einen Master-Transfektionsgemisch, die DNA und Transfektionsreagenz und Aliquotierung es für jeden gut. Drei Brunnen mit Zellen nicht mit DNA transfiziert, die für die Hintergrundfluoreszenzsignal für jede Behandlungsbedingung als Kontrolle dient. ANMERKUNG: Eine alternative Weise Transfektion Variation zu reduzieren ist, Zellen zu transfizieren, vor der Aussaat. Jedoch transfiziert ein großer Anteil von Zellen mit fehlgefaltetem Proteins scheitern reduzierte Lebensfähigkeit zu befestigen oder zeigen mit dieser Methode. Es ist wahrscheinlich, dass einige Zellen möglicherweise nicht die durch Trypsin Verdauung verursacht Stress stehen, wenn toxische misfolded Proteine ​​exprimieren. Als Ergebnis wird die Gesamtfluoreszenzsignal wesentlich reduziert. </li><li> 20-24 Stunden nach der Transfektion, untersuchen Sie die lebenden Zellen unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop für die GFP-Expression mit Anregungswellenlänge von 450 bis 490 nm. </li><li> Entfernen Sie das Medium durch Absaugung. Hinzufügen, etwa 200 ul 1x PBS in jede Vertiefung und dann Restmenge an DMEM-Medium zu entfernen anzusaugen. </li><li> Hinzuzufügen 60 ul Low-Fluoreszenz DMEM-Medium mit 5% FBS und 50 ug / ml CHX. Um den proteasomalen Abbau, zusätzliche Proteasom-Inhibitor MG132 (10 &amp; mgr; M) in einer Reihe von Proben zu untersuchen. Stellen Sie dreifach von Vertiefungen für jede Behandlung / Zustand. HINWEIS: MG132 Behandlung wird als Kontrollen für den proteasomalen Abbau enthalten, da es entscheidend ist, andere Faktoren auszuschließen, die Tropfen Fluo verursachen könnenzenz Signal, einschließlich Zelltod und Fluoreszenzlöschung. </li><li> Messen Sie das Fluoreszenzsignal von GFP sofort auf einem Fluoreszenzplattenleser nach CHX Zugabe. Hinweis: Die Software Messeinstellungen sind in Tabelle 1 gezeigt. </li><li> Lesen Sie jede Stunde die Platte für bis zu 8-10 Stunden. Nach der Lektüre, Rückkehr zur Zellkultur-Inkubator der Platte zurück. </li><li> Exportieren Sie die Daten als Tabellenkalkulationsdatei. Verwenden Mittelwert von Multi liest für jede Vertiefung als Fluoreszenzintensität. Normalisieren Werte jedes Datenpunktes auf die Mittelwerte der Zeit 0 in den jeweiligen Gruppen. Plotten der normierten Fluoreszenzintensität über die Zeit , wie in 4A und 4B gezeigt ist , und Figur 5, rechte Felder. </li><li> Führen Sie eine statistische Analyse der Abbauraten zwischen zwei Zuständen unter Verwendung von Zwei-Wege - ANOVA mit wiederholten Messungen 23. HINWEIS: In dieser Analyse &quot;Fluoreszenzintensität&quot; ist die abhängige Variable während &quot;treatmbungsbedingungen &quot;und&quot; Zeit &quot;sind die beiden Faktoren. Statt Daten zu einzelnen Zeitpunkten zu vergleichen, Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen den Unterschied zwischen den beiden Behandlungsgruppen über die gesamte Zeitverlauf analysiert. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Mechanismen, die den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​sind wesentlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase zellulärer Proteine ​​reguliert, und sie stellen wahrscheinlich wertvolle Arzneimittelziele für neurodegenerative Erkrankungen und anderen eiweiß misfolding Behandlung von Krankheiten. Hier Assays, die den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​untersuchen, werden beschrieben, eine pathogene ATXN1 Protein (ATXN1 82Q) und einem Kern lokalisierten Luciferase-Mutante (NLS-LucDM) als Beispiele verwendet. <...

Proteine ​​sind die am häufigsten vorkommenden Makromolekülen in Zellen, und sie spielen eine wesentliche Rolle in praktisch allen biologischen Prozessen. Die biologische Aktivität der meisten Proteine ​​erfordert deren Faltung in und Wartung, die nativen dreidimensionalen Strukturen. Proteine ​​mit aberranter Konformationen nicht nur ihre normale Funktion verlieren, sondern auch bilden häufig lösliche oligomere Spezies oder Aggregate, die die Funktionen von anderen Proteinen beeinträchtigen und sind toxisch für Zellen 1,2. Um dem entgegenzuwirken , falsch gefaltete Proteine, verwenden Zellen , die beide molekulare Chaperone, die entfaltete oder teilweise gefaltete Polypeptide unterstützen , um ihre native Konformation zu erreichen, und Abbauwege, die falsch gefaltete Proteine ​​3 zu beseitigen. Angesichts der Komplexität und der stochastischen Natur des Faltvorgangs, Protein misfolding unvermeidlich, und es kann nicht in dem Fall von Mutationen, biosynthetische Fehler umgekehrt werden, und posttranslationale Schäden 1. Daher verlassen Zellen schließlich auf degradatIonenwege, um ihre Proteinqualität aufrecht zu erhalten. Die Bedeutung der zellulären Proteinqualitätskontrolle (PQC) -Systemen wird durch das Vorherrschen von Protein-Fehlfaltungen Krankheiten, einschließlich Krebs, Diabetes, und viele neurodegenerative Störungen wie Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Huntington-Krankheit (HD) unterstrichen, und spinocerebellar Ataxien (SCA) 4,5. Beispielsweise Mutationen in dem p53 - Tumorsuppressor ist die einzige am häufigsten genetischen Läsion in Tumoren, verbunden mit ~ 50-70% aller Fälle 6. Ein wesentlicher Anteil von p53 - Mutationen sind Missense - Mutationen , welche die Konformation von p53, was zur Bildung von Aggregaten 7 verändern. Darüber hinaus Proteine ​​mit erweiterter polyQ Strecken sind genetisch und pathologisch mit HD und SCA in Verbindung gebracht. Diese progressiven und oft tödlichen Krankheiten manifestieren, wenn die Länge des polyQ Strecke in den betroffenen Proteine ​​eine bestimmte THRES überschreitethalten, und wird zunehmend schwerer als die Länge des polyQ Strecke 8 verlängert. Ein vielversprechender Ansatz, diese Krankheiten zu behandeln ist, um therapeutisch zellulären PQC Systeme zu stärken, insbesondere die Abbauwege. Jedoch involviert die Wege in der Degradation von fehlerhaften Proteine, insbesondere solche, in Säugerzellen, bleiben wenig verstanden. Obwohl es erkannt wurde, dass das Proteasom für den Abbau von falsch gefalteten Proteine ​​von entscheidender Bedeutung ist, ein zentrales Thema bleibt undefiniert: wie falsch gefaltete Proteine ​​sind für den Abbau spezifisch erkannt und zielgerichtet. Darüber hinaus, obwohl PQC Systeme in zellulären Kompartimenten einschließlich Zytoplasma identifiziert wurden, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Mitochondrium, bleiben die PQC Systeme im Kern unklar 2. Neuere Studien von unserem Labor haben ein System identifiziert, das eine Vielzahl von falsch gefalteten Proteinen in den Zellkern erkennt und verschlechtertvon Säugerzellen 9. Dieses System besteht aus dem promyelocytic Protein (PML), einem Kernprotein und einem Mitglied des tripartite motif enthaltenden (TRIM) Proteinfamilie und RNF4, eine RING-Domäne enthaltendes Protein. PML und mehrere andere Proteine ​​TRIM besitzen SUMO (small ubiquitin-like Modifier) ​​E3 - Ligase - Aktivität, die die Spezifität und Effizienz der Protein SUMOylierung 10 erleichtert. RNF4 gehört zu einer kleinen Gruppe von SUMO-bezogene Ubiquitinligasen (Stübl), die einen oder mehrere Sumo-interacting Motive (SIMs) zusätzlich zu der RING - Domäne , die ihnen die Ubiquitin - Ligase - Aktivität 11 bietet. Wir fanden, dass PML erkennt spezifisch misfolded Proteine ​​durch einzelne Substraterkennungsstellen, die unterschiedliche Merkmale auf falsch gefaltete Proteine ​​erkennen können. Bei der Bindung, PML-Tags fehlgefaltetem Proteine ​​mit poly-Ketten von SUMO2 / 3, zwei nahezu identische Säuger SUMO Proteine, die poly-Ketten aufgrund der Existenz eines internen SUMOylierung Stelle bilden kann. SUMOylated misfolded Proteine ​​werden dann durch RNF4 erkannt, die ihre Ubiquitinierung und Abbau im Proteasom führt. Wir haben gezeigt , weiter , dass die PML-RNF4 System zum Schutz gegen Neurodegeneration wichtig, da Mangel in PML die Verhaltens- und neuropathologischen Defekte eines Mausmodells von SCA Typ 1 (SCA1) 9 verschärft. Um den Proteinabbau von anderen zellulären Mechanismen unterscheiden , die Proteinspiegel regulieren kann, wurde die Rate der Proteinumsatz 9 gemessen. Unter den am häufigsten verwendeten Methoden Proteinumsatz sind Puls Chase und Cycloheximid (CHX) Jagd zu bestimmen. Diese beiden Methoden untersuchen, über die Zeit bzw. die Radioisotop-markierte Proteine ​​von Interesse in übersetzungs bewandert Zellen und Gesamt vorbestehenden Proteine ​​von Interesse in Translation-inhibierten Zellen. Allerdings ist eine große Herausforderung, pathogene und Fehlfaltungen neigende Proteine ​​für die Untersuchung, dass die Halbwertszeit dieser Proteine ​​extrem lo sein kannng. Beispielsweise Ataxin-1, Ataxin-7, Huntingtin, α-Synuclein und TDP-43 haben alle Halbwertszeit von mehr als 12 bis 24 h 9,12-16. Die langsamen Umsatzraten dieser Proteine ​​schließen die Verwendung der Analyse CHX chase, weil die Zellen, die diese Proteine ​​beherbergen kann nicht längere Übersetzung Hemmung überleben, vor allem weil die misfolded Proteine ​​können selbst hochtoxisch für Zellen sein. Die Pulse-Chase-Analyse mit Isotopenmarkierung kann auch für Proteine ​​eine Herausforderung sein, die stark zur Aggregation neigen. Die meisten Pulse-Chase-Assays beruhen auf Immunpräzipitation des Proteins von Interesse von den anderen Proteinen abzutrennen, die auch radioaktiv markiert sind. Dieses Verfahren umfasst in der Regel langwierig Immunpräzipitation und Waschverfahren, bei dem SDS-unlösliche Aggregate bilden können, ungenaue die Analyse mit SDS-PAGE-Elektrophorese zu machen. Hier ist ein Protokoll zur nuklearen misfolded Proteine ​​analysieren mit einem langsamen Umsatzrate 9 beschrieben wird ,. Eine pathogene Form von Ataxin-1 (ATXN1) , die eine Strecke von 82 Glutamine (ATXN1 82Q) enthält , wird zu diesem Zweck 8 verwendet. Wenn in Zellen exprimiert wird , eine verstärkte grün fluoreszierende Protein (GFP) Fusion von ATXN1 82Q Formen mikroskopisch sichtbare Einschlüsse im Kern (1A). Pulse - Chase - Analyse zeigt , dass die Halbwertszeit von Ataxn1 82Q ist über 18 Stunden 9. ATXN1 82Q mit misfolded Konformationen unterschiedlicher Eigenschaften von Arten zusammengesetzt, sowie Spezies mit nativer Konformation. Es ist wahrscheinlich, dass diese Arten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten abgebaut werden, und sollte daher separat analysiert werden. Lysate aus ATXN1 82Q-GFP-exprimierenden Zellen werden fraktioniert in NP-40-löslich (löslich oder NS, wahrscheinlich repräsentieren native Proteine ​​oder falsch gefaltete monomeren / oligomeren Proteine) und NP-40-unlöslichen (NI, aggregiert / misfolded) Portionen. Letztere kann weiter in SDS-löslichen (SS; wahrscheinlich ungeordnete Aggregate) unterteilt werden oder SDS-resistenten (SR; wahrscheinlich Amyloidfibrillen) Fraktionen (1B). NS und SS-Fraktionen können durch SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot, während der SR-Fraktion durch Filterverzögerungs Assays detektiert werden kann durch Immunoblotting gefolgt analysiert werden. CHX chase wird mit dem Detergens Fraktionierungsverfahren kombiniert und entdeckt , dass die Halbwertszeit von SS ATXN1 82Q ist viel kürzer als die von NS ATXN1 82Q und insgesamt ATXN1 82Q (2A), was darauf hinweist , dass die SS - Fraktion leicht erkannt und abgebaut in Zellen 9. Somit stellt diese Methode ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik von falsch gefalteten Proteine ​​zu untersuchen und deren Abbaumuster zu vergleichen. Wir beschreiben auch ein Verfahren, das für Hochdurchsatz-Screening zur Identifizierung von Makromolekülen oder kleinen Verbindungen geeignet ist, die den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​modulieren können. Dieses Verfahren basiert auf einer konformationell destabilisiert Mutante von Glühwürmchen - Luciferase (LucDM) 17, einem Modell Chaperon Substrat. Wir haben Sicherungd LucDM zu einem Kernlokalisationssignal (NLS), die PQC Systeme in diesem Zellkompartiment zu sondieren, und GFP (NLS-LucDM-GFP) zur Erleichterung der Erkennung. NLS-LucDM-GFP Formen mikroskopisch sichtbare Kern Aggregate in einem kleinen Prozentsatz der Zellen (3A). Ähnlich wie bei ATXN1 82Q, NLS-LucDM-GFP-aber nicht seine Wildtyp - Gegenstück NLS-LucWT-GFP-durch SUMO2 / 3 modifiziert und reguliert durch die PML-RNF4 Weg 9. NLS-LucDM-GFP bildet auch SS und SR-Arten, obwohl die relativen Mengen von SS und SR Spezies minimal sind im Vergleich zu NS, unter Verwendung der in Protokoll 3 unten beschriebenen Bedingungen. Um den Assay zu vereinfachen, analysieren wir nur SDS löslich LucDM (einschließlich sowohl der NS und SS-Fraktionen) durch SDS-PAGE und Western Blot. Wichtig ist , zeigte CHX chase - Assay , dass die Halbwertszeit von SDS-löslichen NLS-LucDM-GFP ist viel kürzer als die der Wildtyp - Gegenstück (3B), was darauf hindeutet , dass LucDM ein spezifisches Substrat für das System ist , das und verschlechtert erkenntmisfolded Proteine. Der Abbau von LucDM-GFP führt zu einem deutlichen Rückgang der Gesamtfluoreszenzsignal. Daher haben wir entwickelt auch ein Protokoll für Echtzeit-Erkennung von zellulärer LucDM-GFP Fluoreszenz basierenden Assay unter Verwendung von Mikrotiterplatten. Viele Hochdurchsatz - Screening (HTS) Systeme für Medikamente oder Gene Zellaggregaten und zelluläre Lebensfähigkeit durch anomale Proteine ​​18-20 verursacht Modifikation entwickelt. Jedoch sind sehr wenige HTS speziell für den Abbau in Säugerzellen abzielt. Dieses Protokoll dient als robustes System für die schnelle und umfangreiche Analyse der Auswirkungen der Proteinexpression, Knockdown und medikamentöse Behandlung auf die zelluläre misfolded Proteinabbau. Verwendung von HeLa-Zellen, wie beispielsweise unterhalb wir die Protokolle für die Analyse dieser beiden misfolded Proteine ​​beschreiben. Die Assays können auch auf andere Zelllinien angewendet werden, obwohl Transfektionsbedingungen und Zeitverlauf benötigen für einzelne Zelllinien optimiert werden.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11995-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NP40S-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8699</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45000232</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche Boehringer Mannheim</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors GFP Monoclonal Antibody</td><td>Clonetech</td><td>632375</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin mAb Rabbit, IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A45060-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium</td></tr><tr><td>Olympus IX-81&amp;nbsp; Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX81</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom</td><td>Sigma-Greiner</td><td>89135-048</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200&amp;reg; PRO</td><td>TECAN</td><td>Infinite 200&amp;reg; PRO</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose acetate membrane 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sterlitech</td><td>CA023001</td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistical analysis software</td></tr></tbody></table>

assays for the degradation of misfolded proteins in cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

50% der HeLa - Zellen 20 Stunden nach der Transfektion (1A) - in einem stationären Zustand Analyse können mikroskopisch sichtbare ATXN1 82Q-GFP Kern Aggregate in 30 beobachtet werden. Western - Blot - Analyse von NS und SS - Fraktionen unter Verwendung von Anti-GFP - Antikörper zeigt eine deutliche Bande von ATXN1 82Q-GFP zwischen 100 kDa und 150 kDa - Marker, an das Protein des Molekulargewicht entspricht (1B). ATXN1 82Q-GFP in der SR - Fraktion kann...

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Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine ​​in Zellen

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Aufrufe.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening. 

Serie: Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

Fraktionierung für Auflösung von löslichen und unlöslichen Huntingtin-Arten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Forschung

Biochemie

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Neurowissenschaften

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biologie

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Untersuchen proteasomalen Abbau in einem zellfreien System in Pflanzen

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

Source: Lee, H. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56425">Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Aggregate Formation Assay: Eine Methode zum Nachweis und zur Quantifizierung der Proteinaggregation in kultivierten Zellen nach Induktion durch Proteasom-Inhibitoren

Source: Lee, H. et al. Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells. J. Vis. Exp. (2017)
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Assay Techniques

Biochemical assays

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Assay für den Abbau von fehlgefalteten Proteinen: Eine Technik zur Überwachung des Abbaus fehlgefalteter Proteine mittels Cycloheximid-Behandlung und Detergenzfraktionierung

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
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Assays für den Abbau fehlgefalteter Proteine in Zellen

Zusammenfassung

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