Dieser umfassende Dissektions- und Analyse-Workflow bietet einen neuartigen Ansatz zur Analyse der vollständigen Morphologie einzelner Geschmacksnervenlauben, der Transduktion von Zelltypzahlen und der physischen Beziehungen zwischen Zellen. Das Sammeln des gesamten Lingualepithels ermöglicht es uns, die absolute Anzahl der Zellen und das Volumen der Innervation innerhalb der gesamten Geschmacksknospe zu messen. Dieser Ansatz ist genauer als Schätzungen der Zellstruktur auf der Grundlage von Stichproben aus Abschnitten, was die technische Variabilität verringert.
Dies ist auch die erste Methode, die eine detaillierte Analyse der Geschmacksknospenzellen in Bezug auf ihre Innervation ermöglicht. Diese Methode kann untersuchungen der potenziellen Schaltkreise in der Geschmacksknospe sowie Krankheitsprozesse und Chemotherapien, die die normale Geschmacksfunktion stören, verbessern. In den meisten dieser Fälle ist unklar, welche Struktur oder Beziehung gestört ist, so dass die Aufrechterhaltung all dieser Faktoren alle Analysen innerhalb eines einzigen Präparats ermöglicht.
Der häufigste Fehler ist der Versuch, eine Schädigung des Epithels zu vermeiden, indem man nicht nahe genug an der Unterseite des Epithels seziert. Es ist unerlässlich, so viel darunter liegendes Gewebe wie möglich zu entfernen, bevor das Gewebe in der Gewebeform eingefroren wird. Es ist auch wichtig sicherzustellen, dass das Epithel flach im Boden der Gewebeform liegt.
Beginnen Sie mit dem Auftauen und Spülen der Zunge in 0,1 molarem Phosphatpuffer. Legen Sie dann 1/2 der vorderen Zunge, die die fungiformen Papillen enthält, unter einem Seziermikroskop auf einen Glasobjektträger. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette und eine Dissektionsschere, um den Muskel zu entfernen und das Gewebe offen zu halten, während das Lingualepithel gekrümmt ist, um eine flache Ausrichtung des Gewebes zu gewährleisten, indem Sie die Klingen der groben Dissektionsschere parallel zum Epithel halten.
Verwerfen Sie das ventrale nicht keratinisierte Epithel der Zunge, da es keine Geschmacksknospen enthält. Verwenden Sie dann eine feine Dissektionsschere für eine engere Dissektion an der Unterseite des keratinisierten Epithels. Verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um ein Stück Epithel in eine Gewebeform zu legen und sicherzustellen, dass es flach liegt.
Fügen Sie dann dem Gewebe einen Tropfen optimaler Schnitttemperaturverbindung oder OCT hinzu. Legen Sie die Gewebeform auf eine zuvor gekühlte Metallbasis unter dem Sezierfernrohr und klopfen Sie dann mit der Pinzette leicht auf das Gewebe, bis das OCT eingefroren ist, um sicherzustellen, dass das Gewebe so flach wie möglich gefriert. Sobald das OCT gefroren ist, fügen Sie schnell zusätzliches OCT hinzu und legen Sie die Form in ein Becherglas aus abgekühltem 2-Methylbutan, bis es eingefroren ist.
Montieren Sie die OCT-Form auf dem Kryostaten und schneiden Sie sie in 20-Mikron-Abschnitte. Sammeln Sie jeden Abschnitt und betrachten Sie ihn unter dem Lichtmikroskop, um seine Nähe zur Basis des Epithels zu beurteilen. Nachdem das Gewebe von der Unterseite des Epithels rasiert wurde, tauen Sie das Epithel auf und spülen Sie es zweimal in 0,1 molarem PB auf einem Shaker aus.
Schneiden Sie den harten Gaumen anterior bis zur Verbindung des weichen und harten Gaumens, trennen Sie dann den weichen Gaumen vom darunter liegenden Gewebe, stellen Sie sicher, dass alle verbleibenden Knochenfragmente weggeschnitten werden und entfernen Sie zusätzliche Muskel- und Bindegewebe. Halten Sie den Gaumen mit stumpfer Pinzette und entfernen Sie die restlichen Drüsen und verlieren Sie Bindegewebe, indem Sie sie vorsichtig mit einer Rasierklinge abkratzen. Ganze Geschmacksknospen und alle Geschmacksknospeninnervationen bei Phox2b-Cre TdTomato-Mäusen wurden durch Färbung des Lingualepithels mit Antikörpern für DsRed und Keratin acht markiert.
Das Geschmacksknospenvolumen wurde gemessen und ergab keine Korrelationen zwischen Geschmacksknospenvolumina und Innervationsvolumina in den Fungiform- oder Zirkumvallat-Messregionen. Die Verabreichung einer niedrigen Dosis Tamoxifen in TrkB CreER TdTomato-Mäusen verursacht eine Genrekombination und die Markierung einer kleinen Anzahl von Neuronen. Eine ganze Geschmacksknospe, die mit geschmackstransduzierenden Zellmarkern Carboanhydrase vier und Phospholipase C beta zwei gefärbt ist, ist hier gezeigt.
Diese Geschmacksknospe hat zwei markierte Terminallauben, die gezeigt werden, wenn die Geschmacksknospe nach der Rekonstruktion der Fasern entfernt wurde. Die Verwendung von zellpixelbasierter Bildgebungssoftware zur Bestimmung der engsten Nähe zwischen Nervenfasern und geschmackstransuzierenden Zellen ergab, dass von 19 geschmackstransduzierenden Zellen der blaue terminale Dorn innerhalb von 200 Nanometern der hellblauen Carboanhydrase vier plus Zelle lag. Der terminale Dorn, der mit der grünen Spur verbunden ist, ist in Magenta dargestellt und befindet sich innerhalb von 200 Nanometern sowohl von der hell- als auch von der dunkelblauen Carboanhydrase vier plus Zellen.
Die Färbung von Fungiform-Geschmacksknospen mit Keratin eight und 5-Ethynyl-2'deoxyuridin oder EdU zeigte, dass EdU-markierte Zellen sowohl innerhalb als auch außerhalb der Geschmacksknospen vorhanden waren. Die magentafarbenen und violetten Kerne werden außerhalb der Keratingrenze plus Grenze der Geschmacksknospe beobachtet. Die gelben, türkisfarbenen und blauen Zellen befanden sich in der Geschmacksknospe.
Beim Versuch dieses Protokolls sind die Schritte zur Gewebedissektion und zum Einfrieren von entscheidender Bedeutung. Diesen Gewebedissektionsmethoden kann eine Färbung für eine Vielzahl von Zellen und Strukturen folgen, um die Beziehungen sowohl innerhalb der Geschmacksknospe als auch außerhalb der Geschmacksknospe, aber innerhalb der Papille zu analysieren. Dies ist die erste Analyse ganzer Geschmackslauben innerhalb der Geschmacksknospe sowie ihrer Beziehungen zu geschmackstransuzierenden Zellen.
Die Konservierung und Färbung für mehrere dieser Elemente in einem einzigen Präparat erweitert sowohl die Möglichkeiten der Analyse als auch verfeinert die möglichen Messungen.
