In diesem Videoprotokoll zeigen wir im Detail, ein Kultursystem für den Anbau von Rindereioozyten. Das System unterstützt die Eizellen-Lebensfähigkeit in der Kultur für bis zu fünf Tage und ermöglicht deren Differenzierung. Mit diesem Kultursystem können Eizellen, die aus kleinen Antralinefollikel gesammelt werden, die normalerweise nicht in Standardprotokollen für In-vitro-Protokolle in der Produktion verwendet werden, angebaut werden, um die Verfügbarkeit von befruchtbaren Gameten zu erhöhen.
Diese Nutzung des größeren Reservats kann neue Möglichkeiten für die genetische Bergung bedrohter Arten, der Rinderfamilie oder lokaler Rassen bieten, die von genetischer Erosion bedroht sind. Zu Beginn 15 Milliliter Grundkulturmedium vorbereiten und nach Manuskriptanweisungen ergänzen. Als nächstes bereiten Sie drei Milliliter Haltemedium vor, indem Sie dem Grundkulturmedium fünf Mikromolar-Cilostamid hinzufügen und in eine 35-Millimeter-Petrischale gießen.
Bereiten Sie lange IVCO Medium durch Ergänzung der Grundkultur Medium nach Manuskript Richtungen. Fügen Sie 200 Mikroliter langes IVCO-Medium zu jedem Brunnen einer 96-well beschichteten Platte hinzu. Dann füllen Sie die vier Kanten mit sterilem Wasser, um die Verdunstung zu kompensieren und die entsprechende Feuchtigkeit während der Kultur zu erhalten.
Inkubieren Sie die 96-Well-Platte und das Haltemedium bei 38,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bei maximaler Luftfeuchtigkeit. Waschen Sie die Eierstöcke viermal in steriler Salin, bei 26 Grad Celsius gehalten. Dann aspirieren Sie alle Follikel, die mehr als zwei Millimeter im Durchmesser sind, mit einer 18-Spur-Nadel, die mit einer Aspirationspumpe verbunden ist.
Schnüren Sie die angesaugten Eierstöcke in einem Becher mit steriler Salin, die bei 26 Grad Celsius gehalten wird. Legen Sie einen Eierstock nach dem anderen auf ein steriles PTFE-Schneidebrett und verwenden Sie eine chirurgische Klinge der Nummer 22, um Scheiben des Eierstockhirns zu schneiden, die 1,5 bis zwei Millimeter dick sind und parallel zur Hauptachse des Organs verlaufen. Schnüren Sie die Scheiben der Eierstock-Kortex in einer sterilen Glas Petrischale, mit Sezieren Medium auf einer warmen Platte, bei 38,5 Grad Celsius.
Schnüren Sie eine Ovarial-Kortexscheibe in einer 60-Millimeter-Glas-Petrischale, mit zwei bis drei Milliliterm M199D unter einem Seziermikroskop, wählen Sie die Follikel aus, die zwischen 5 und zwei Millimetern liegen. Identifizieren Sie die gesunden nicht-atretischen Follikel unter dem Stereomikroskop, indem Sie morphologische Parameter wie ein gleichmäßig helles transluzentes Erscheinungsbild, eine umfangreiche Vaskularisation und eine regelmäßige Granulosaschicht beobachten. Während atretische Follikel haben ein graues undurchsichtiges Aussehen, und sind schlecht vaskularisiert, mit einem dunklen COC im Inneren.
Entsorgen Sie die atretischen Follikel und verarbeiten Sie alle anderen. Verwenden Sie die chirurgische Klinge, um das Eierstockgewebe, das den Follikel umgibt, auf einer Seite zu entfernen, bis es freigelegt wird. Verwenden Sie dann eine 26-Spur-Nadel, um sorgfältig einen Schlitz in der exponierten Follikelwand zu machen, der den Follikelgehalt freisetzt, der den COC, die Follikelflüssigkeit und die Zellklumpen umfasst.
Identifizieren Sie das COC und untersuchen Sie es auf Cumulusintegrität, Zona pellucida Integrität und Homogenität des Zytoplasmas. Wenn diese Kriterien erfüllt sind, aspirieren Sie das COC mit einer P20 Pipette. Schnüren Sie das isolierte COC in M199D Cilostamid, und setzen Sie den Isolationsvorgang für 30 Minuten fort.
Nach der Auswahl der COCs, wie zuvor beschrieben, bereiten Sie 16 Tropfen mit 20 Mikroliter M199D Cilostamid in einer 60-Millimeter-Petrischale vor und legen Sie einen gesunden COC in jeden Tropfen. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, das an einer Kamera befestigt ist, um den Oozytendurchmesser zu messen, mit Ausnahme der Zona pellucida. Mit einer klaren Visualisierung der Eizelle, machen Sie zwei senkrechte Messungen, stellen Sie sicher, dass der Mittelwert der beiden Messungen in einem Bereich von 100 bis 110 Mikrometern liegt.
Aufgrund der begleitenden Cumuluszellen kann es schwierig sein, den Oozytendurchmesser genau zu messen. COCs, die Eizellen mit kleinerem oder größerem Durchmesser haben oder keine abgerundete Oozyte haben, oder solche mit Nicht messbaren Eizellen sollten verworfen werden. Übertragen Sie die ausgewählten COCs in eine 35-Millimeter-Schale mit M199H-Medium und halten Sie sie im Inkubator bei 38,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bei maximaler Luftfeuchtigkeit, stellen Sie sicher, dass die Gesamtarbeitszeit zwei Stunden nicht überschreitet.
Sobald die Auswahl- und Abholverfahren abgeschlossen sind, übertragen Sie einen COC in die Mitte jedes Brunnens der zuvor vorbereiteten 96-Well-Platte. Inkubieren Sie die Platte für fünf Tage bei 38,5 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit maximaler Luftfeuchtigkeit, erfrischen Sie das Medium jeden zweiten Tag. Um das Medium zu erneuern, ersetzen Sie 100 Mikroliter des alten Mediums durch 100 Mikroliter frisches langes IVCO-Medium, tun Sie dies unter dem Stereomikroskop, um eine Verschiebung der COCs zu vermeiden.
Analysieren Sie am Ende des langen IVCO die COCs-Morphologie. Wenn sie eine kompakte Cumuluszelleninvestition ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion oder Zelldegeneration haben, klassifizieren Sie sie als Klasse eins. Wenn die COCs eine kompakte Cumuluszelleninvestition ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion oder Zelldegeneration haben und mit einer oder mehreren antrumartigen Formationen, klassifizieren Sie sie als Klasse zwei.
Klasse drei COCs, zeigen mehrere Schichten von Cumuluszellen ohne Anzeichen einer Cumulusexpansion, einige disaggregierte Zellen in der äußeren Schicht der Cumuluszellen und keine antrumartige Bildung. Klassifizieren Sie die COCs als Klasse vier, wenn sie einen reichlichen Verlust von Cumuluszellen aufweisen, die sich über mehr als 50 % der Eizellenoberfläche erstrecken, sowie Anzeichen einer Zelldegeneration und Zellablagerungen. Am Ende der langen IVCO wird die grobe Morphologie des COC verändert.
Und vier Klassen wurden anhand des Aussehens der Cumuluszellen identifiziert. Insgesamt wurden 74 Eizellen in fünf biologischen Repliken analysiert, von denen 9,45% aus der weiteren Auswertung verworfen wurden. Die Klassen eins, zwei und drei wurden als gesund eingestuft, während Klasse vier deutliche Anzeichen einer Degeneration aufwies, wie das Fehlen vollständiger Schichten von Cumuluszellen, die die Eizellen umgaben.
Diese COCs wurden als ungeeignet erachtet, um sich nachgelagerten Verfahren in einer prospektiven IVP-Einstellung zu unterziehen. Die Beurteilung des meiotischen Stadiums am Ende des langen IVCO ergab, dass ein deutlich höherer Prozentsatz der Eizellen im unreifen Stadium festhielt, wobei das Chromatin noch im GV eingeschlossen war. Bei der Untersuchung der Chromatinkondensation innerhalb des GV als Marker des Kompetenzgewinns wurde in 59 % der Eizellen der Übergang der Chromatinkonfiguration zu kondensierteren Stufen, nämlich GV zwei und GV 3, beobachtet. Ein kleiner Prozentsatz nahm die Meiose wieder auf und erreichte eine Phase der Metaphase oder Degeneration.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die L-IVCO-Kultur die Eizellenlebensfähigkeit unterstützt und gleichzeitig die meiotische Wiederaufnahme für fünf Tage verhindert. Am Ende der langen IVCO können die COCs in nachgelagerten Verfahren der In-vitro-Embryoproduktion eingesetzt werden, nämlich in vitro reifung, Fertilisation und Embryokultur. Diese Schritte sind notwendig, um den Beweis des Konzepts zu erbringen, dass die Eizelle eine höhere Entwicklungskompetenz erworben hat.
Neben dem Potenzial, die Menge an befruchtbaren Eizellen zu erhöhen, ist das lange IVCO-Kultursystem ein Werkzeug für Wissenschaftler, die daran interessiert sind, die zellulären und molekularen Prozesse zu sezieren, die die Bildung einer kompetenten Gamete regulieren.
