Dies ist das erste Protokoll, das die erfolgreiche Koinfektion des kortikospinalen Trakts bei neugeborenen Ratten zeigt. Es liefert eine genaue Blaupause, um zu untersuchen, wie einzelne Subpopulationen von Zellen in jungen Säugetieren zur Genesung von Rückenmarksverletzungen beitragen. Wie andere doppelte virale Vektortechniken ermöglicht diese Methode dem Benutzer, spezifische Subpopulationen von Neuronen genau zu transduzieren, so dass die Forscher die Wirksamkeit verschiedener chemogenetischer Techniken bei der Förderung der Genesung identifizieren können.
Wir würden erwarten, dass Forscher, die mit dieser Technik nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, die richtige Wirbelsäulenanatomie zu finden. Und so ermutigen wir Sie, die Wirbelsegmente kontinuierlich oft zu zählen und immer auf Ihre Orientierungspunkte zurückzugreifen. Nachdem Sie die Tiefe der Anästhesie bei einem neugeborenen Sprague Dawley-Welpen bestätigt haben, identifizieren Sie den Bereich, in dem der Schnitt gemacht wird, indem Sie die Pinzette in der Mittellinie auf die Oberseite der Kopfhaut drücken und nach der sagittalen Naht tasten.
Halten Sie die Haut straff, um einen sauberen, geraden und präzisen Schnitt zu gewährleisten, und machen Sie einen Schnitt von einem Zentimeter entlang der sagittalen Nahtebene, der unmittelbar über der I-Linie beginnt. Als nächstes identifizieren Sie das Bregma, indem Sie die Pinzette vorsichtig entlang der Schädeloberfläche abtasten, wobei Sie genau auf die Nahtlinien und eine Vertiefung achten, die durch die Zange verursacht wird, die entlang der Parietal- und Stirnbeinknochen verläuft. Halten Sie die Öffnung aufrecht, indem Sie gewichtete Haken auf der interessierenden Seite anbringen.
Beseitigen Sie die Aponeurose mit einer Kombination aus Baumwollspitzen und Mikroschere, um die Exposition des Bregmas für eine erhöhte Genauigkeit zu maximieren. Stellen Sie sicher, dass die koronale Naht seitlich weit genug sichtbar ist, um eine grobe Schablone für nachfolgende Injektionen zu bieten. Schneiden Sie mit der Mikroschere einen etwa drei mal zwei Millimeter großen Abschnitt des linken vorderen Schädelknochens unmittelbar neben dem Bregma aus.
Entfernen Sie alle Ablagerungen, Zerebrospinalflüssigkeit und Blut mit Baumwollspitzen. Um das Virus zu injizieren, setzen Sie die Nadel ein und programmieren Sie den Injektor so, dass er einen Mikroliter mit einer Geschwindigkeit von 250 Nanolitern pro Minute injiziert. Lassen Sie die Nadel nach Abschluss der Injektion drei Minuten lang im Kortex ruhen.
Wiederholen Sie die Injektionen an den anderen Koordinaten für insgesamt drei Injektionen entlang des Kortex in Bezug auf die Bregma, alle in einer Tiefe von 0,6 Millimetern. Nach Abschluss der Injektionen vernähen Sie die Kopfhaut und bringen Sie das Tier zur zervikalen Laminektomie auf den anderen Operationstisch. Palpieren Sie die Schädelbasis mit den Fingern, um die Inzisionsstelle zu identifizieren.
Halten Sie die Haut straff, indem Sie mit Daumen und Zeigefinger Spannung ausüben. Beginnen Sie mit einer Klinge mit der Nummer 11 den Schnitt an der Mittellinie ein bis zwei Millimeter hinter der Schädelbasis und verlängern Sie den Schnitt um einen Zentimeter nach hinten, um den oberflächlichen Muskel freizulegen. Machen Sie mit der scharfen Spitze der Klinge vorsichtig eine Reihe von Schnitten entlang der Mittellinie des oberflächlichen Muskels, um die Wirbelsäulenhöhle und die tiefe Wirbelsäulenmuskulatur freizulegen.
Verwenden Sie dann eine Pinzette, um den Muskel zu spreizen und das Operationsfenster zu visualisieren. Sobald die tiefe Wirbelsäulenmuskulatur freigelegt wurde, führen Sie Retraktoren in das Operationsfenster ein und ziehen Sie das Operationsfenster auf sieben bis acht Millimeter Breite zurück, um eine ungehinderte Sicht auf die Wirbelsäule zu ermöglichen. Identifizieren Sie den zweiten Halswirbel an seinem prominenten Dornfortsatz, der dorsal hervorragt und einen großen kuppelförmigen Muskel umschließt.
Kratzen Sie mit der flachen Kante eines Knochenschabers den tiefen Wirbelsäulenmuskel vorsichtig zu den Seiten ab, um die C3- bis C7-Wirbel freizulegen. Beginnen Sie medial und kratzen Sie seitlich entlang der Richtung parallel zu den Wirbellaminae, um eine ordnungsgemäße Exposition zu gewährleisten, die eine klare Unterscheidung der Wirbellaminae ermöglicht. Kontrollieren Sie Blutungen mit Baumwollspitzen.
Schneiden Sie die Seitenränder der Knorpellaminae bei C6 und C7 vorsichtig mit einer Mikroschere ab, indem Sie C2 als Richtschnur bei der Zählung der Wirbelebenen verwenden. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig den präparierten Teil der Lamina, um das Rückenmark freizulegen, und stellen Sie sicher, dass das Wirbelsäulenfenster groß genug ist, um die gewünschte Injektionsstelle aufzunehmen. Setzen Sie das Tier in den stereotaktischen Schädelhalter und legen Sie ein zusammengerolltes Stück Gaze unter den Rüssel des Tieres, um seine Hinterhand anzuheben.
Bevor Sie mit der Injektion beginnen, reinigen Sie das Wirbelsäulenfenster von Blut oder Liquor cerebrospinalis, indem Sie vorsichtig Baumwollspitzen und Sugi-Dreiecke auf den Bereich auftragen und darauf achten, das Rückenmark nicht zu beleidigen. Schaffen Sie außerdem eine Barriere um den Umfang des Fensters, indem Sie ein kleines Stück resorbierbare Baumwolle in die seitlichen Teile des Wirbelsäulenfensters legen, um einen Verschluss der Injektionsstelle durch kontinuierliche Blutungen oder Liquorleckagen zu verhindern. Für direkte Injektionen in das Rückenmark verwenden Sie die Spitze der Glasinjektionsnadel, um sich der Mittellinie des Rückenmarks anzunähern, indem Sie die Spinalarterie identifizieren.
Als nächstes platzieren Sie die Nadel direkt hinter der C5-Lamina an der ungefähren Mittellinie und verwenden Sie diese als Referenzpunkt. Bewegen Sie dann mit dem Mikromanipulator die Nadel seitlich um 0,3 Millimeter nach rechts und senken Sie die Nadel ab, bis sie nur noch die Oberfläche des Rückenmarks berührt. Tauchen Sie die Nadel aus dieser Tiefe ein.
0,6 Millimeter in das Rückenmark. Injizieren Sie einen Mikroliter des retro-adeno-assoziierten Virus, von denen zwei das Cre-Rekombinase-Gen mit 250 Nanolitern pro Minute tragen. Warten Sie dann zwei Minuten, bis das Virus in das Rückenmark diffundiert ist, bevor Sie die Nadel langsam zurückziehen.
Die Markierung von Neuronen der fünften Schicht des kortikospinalen Trakts im motorischen Kortex eines koronalen Hirnschnitts, die Cre-abhängige DREADDs mCherry exprimieren, die mit einer kontralateralen Wirbelsäuleninjektion von Retro-Cre koinjiziert wurden, ist hier dargestellt. Die Möglichkeit, bestimmte neuronale Populationen anzusprechen, wird dazu beitragen, die Nuancen zu beschreiben, die die Genesung vorantreiben, und eine genauere Behandlung der zugrunde liegenden Rückenmarksverletzung im sich entwickelnden Nervensystem ermöglichen. Diese Methode ebnete uns den Weg, die Machbarkeit der Verwendung von exzitatorischen DREADDs als Mittel zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen bei juvenilen Ratten zu untersuchen.
