Das Darmorgankultursystem vereint die Vorteile von in vitro und in vivo Assays und dient somit als experimenteller Zwischenschritt zwischen einfachen in vitro Assays und komplexen in vivo Experimenten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Kombination einer strengen experimentellen Kontrolle mit der Erhaltung der Darmphysiologie. Diese Methode liefert Einblicke in die Analyse der Darmreaktionen auf spezifische Reize mit einem hohen Maß an Kontrolle über den Wirt, die Mikroben und die Umweltkomponenten.
Demonstriert wird das Verfahren von Alon Shemesh, einem Masterstudenten aus meinem Labor, und Dr. Sivan Amidror, unserem Labormanager. Führen Sie zunächst die stumpfen Nadeln an die entsprechende Position innerhalb der Geräteform ein und gießen Sie etwa 20 Gramm Polydimethylsiloxan oder PDMS-Mischung für einen Satz des Geräts und des Deckels. Legen Sie die Formen für 30 Minuten in eine Vakuumkammer, um Luftblasen aus der PDMS-Mischung zu entfernen, und inkubieren Sie die Formen dann über Nacht bei 55 Grad Celsius, um die PDMS-Polymerisation abzuschließen.
Wenn das PDMS eingestellt ist, ziehen Sie die Nadeln aus der Form heraus und lösen Sie vorsichtig das Kulturgerät und den Deckel aus den Kunststoffformen. Entfernen Sie PDMS-Rückstände aus dem Brunnenumriss mit einer chirurgischen Klinge. Befestigen Sie das PDMS-Gerät und die Geräteabdeckung mit ungiftigem Silikonkleber auf einem Deckglas aus 75 x 50 Millimetern Mikrorutschen und lassen Sie die Teile über Nacht einwirken.
Tragen Sie das Geklebte auf die glatte Seite des Geräts auf. Setzen Sie 12, 22 Messnadeln für das Lumen und 12, 18 Messnadeln für den Brunnen ein. Fixieren Sie alle Nadeln mit Silikon und lassen Sie es über Nacht einwirken.
Reinigen Sie die Eingangsspritzen und stellen Sie sicher, dass das Brunnenmedium aus allen Rohren in ein Altglas fließt, reinigen Sie dann die Eingangsspritzen und stellen Sie sicher, dass die Stimulationen aus allen Rohren in ein Altglas fließen, wobei Sie darauf achten, die verschiedenen Stimulationen nicht zu kontaminieren. Nachdem Sie die Maus geopfert haben, verwenden Sie eine scharfe Schere und eine Zette, um sie zu sezieren und den Verdauungstrakt vom Magen bis zum Anus herauszunehmen, indem Sie das gesamte Fett und Bindegewebe schneiden. Schneiden Sie den Doppelpunkt ab und legen Sie ihn auf eine neue Platte.
Minimieren Sie den Kontakt, während Sie das Gewebe sanft und nur an den Rändern halten. Führen Sie die Dickdarmspülung unter einem Dissektionsmikroskop durch. Spülen Sie den Dickdarminhalt vorsichtig mit sterilem IMDM mit der vorbereiteten 10-Milliliter-Spritze, wie im Text beschrieben.
Nachdem Sie den Kot aus dem Darmgewebe entfernt haben, legen Sie den Dickdarm in eine neue Sechs-Well-Platte, die mit 0,5 Milliliter sterilem IMDM gefüllt ist. Als nächstes nehmen Sie das Dickdarmgewebe und verbinden Es vorsichtig mit der 22-Gauge-Nadel, wobei Sie eine enge Verbindung mit den beiden Fäden herstellen. Behalten Sie die korrekte Ausrichtung des Dickdarms zum Lumenfluss bei, so dass der proximale und der distale Ausgang gleich Eingang und Ausgang sind.
Wiederholen Sie die Darmspülung und das Nadelknünden für alle Gewebe. Schließen Sie die Ein- und Ausgangsrohre an das Gerät an und beginnen Sie dann das Experiment, indem Sie die Pumpen mit den gewünschten Raten starten. Schleimgefüllte Speisebleszellen im Dickdarmepithel und Schleimsekretion im Lumen wurden ebenso nachgewiesen wie proliferierende IEC in den Kolonkrypten, wie durch KI67-Färbung angezeigt.
Diese Ergebnisse zeigten, dass das Darmkultursystem die Darmfunktion und -struktur ex vivo aufrechterhält. Nach zwei Stunden segmentierten filamentösen Bakterien oder SFB-Einführung wurden typische SFB-Filamente in enger Verbindung mit Dünndarmzotten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung nachgewiesen. Zusätzlich präsentierte eine Transmissionselektronenmikroskopie SFB innerhalb weniger Mikrometer der Dünndarmepithelbürstengrenze.
Genexpressionsprofile ganzer Gewebeproben wurden in dreifacher Ausfertigung zwei Stunden nach der Infusion mit SFB erstellt. Kontrollkulturen wurden mit fäkalen Suspensionen von keimfreien oder Bacteroides fragilis monokolonisierten Mäusen infundiert. Diese vom SFB überzeugten Veränderungen waren im Vergleich zur keimfreien Kontrolle überwiegend von geringer Amplitude.
Die Orientierung des Dickdarms ist sehr wichtig. Achten Sie besonders darauf, wenn Sie den Dickdarm an der Nadel binden. Die richtige Bindung verhindert die Kontamination des Brunnens mit dem Lumengehalt.
Diesem Protokoll kann eine breite Palette von Auslesetechniken folgen, z. B. Sequenzierung der nächsten Generation, Bildgebung, Zellsortierung und vieles mehr. Diese Auslesungen bieten neue Einblicke in die Wechselwirkungen des Wirtsmikrobioms bei Gesundheit und Krankheit.
