Il sistema di coltura degli organi intestinali combina i vantaggi dei saggi in vitro e in vivo e funge quindi da fase sperimentale intermedia tra semplici saggi in vitro a complessi esperimenti in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è la combinazione di uno stretto controllo sperimentale con la conservazione della fisiologia intestinale. Questo metodo fornisce informazioni per analizzare le risposte intestinali a stimoli specifici con un alto livello di controllo sui componenti ospiti, microbici e ambientali.
A dimostrare la procedura saranno Alon Shemesh, uno studente di Master del mio laboratorio, e il Dr.Sivan Amidror, il nostro responsabile di laboratorio. Per iniziare, inserire gli aghi smussati nella posizione appropriata all'interno dello stampo del dispositivo e gettare circa 20 grammi di polidimetilsilossano o miscela PDMS, per un set del dispositivo e del coperchio. Posizionare gli stampi in una camera a vuoto per 30 minuti per rimuovere le bolle d'aria dalla miscela PDMS, quindi incubare gli stampi a 55 gradi Celsius durante la notte per completare la polimerizzazione PDMS.
Quando il PDMS è impostato, estrarre gli aghi dallo stampo e rilasciare con attenzione il dispositivo di coltura e il coperchio dagli stampi in plastica. Rimuovere i residui di PDMS dal contorno del pozzo utilizzando una lama chirurgica. Collegare il dispositivo PDMS e il coperchio del dispositivo su un vetro di copertura di microslidi da 75 per 50 millimetri utilizzando adesivo siliconico non tossico e lasciare che le parti si insertino durante la notte.
Applicare l'incollato sul lato liscio del dispositivo. Inserire 12, 22 aghi di calibro per il lume e 12, 18 aghi di calibro per il pozzo. Fissare tutti gli aghi in posizione con silicone e lasciarlo impostare durante la notte.
Spurgare le siringhe in ingresso e assicurarsi che il mezzo del pozzo fuoriesca da tutti i tubi in un vetro di scarto, quindi spurgare le siringhe in ingresso e assicurarsi che le stimolazioni fluiscano da tutti i tubi in un vetro di scarto, facendo attenzione a non contaminare le diverse stimolazioni. Dopo aver sacrificato il topo, usa forbici affilate e pinza per sezionarlo ed estrai il tratto digestivo dallo stomaco all'ano, tagliando tutto il grasso e i tessuti connettivi. Tagliare il colon e posizionarlo su un nuovo piatto.
Ridurre al minimo il contatto tenendo il tessuto delicatamente e solo ai bordi. Eseguire il lavaggio del colon al microscopio di dissezione. Lavare delicatamente il contenuto del colon con IMDM sterile con la siringa da 10 millilitro preparata come descritto nel testo.
Dopo aver rimosso le feci dal tessuto intestinale, posizionare il colon in una nuova piastra a sei pozzetti riempita con 0,5 millilitri di IMDM sterile. Quindi, prendi il tessuto del colon e collegalo con attenzione all'ago calibro 22, facendo una cravatta stretta con i due fili. Mantenere il corretto orientamento del colon al flusso lumen, in modo tale che il prossimale e il distale siano uguali rispettivamente all'ingresso e all'uscita.
Ripetere il lavaggio del colon e legare l'ago per tutti i tessuti. Collegare i tubi di ingresso e uscita al dispositivo, quindi iniziare l'esperimento avviando le pompe alle velocità desiderate. Sono state rilevate cellule calicio piene di muco nell'epitelio del colon e la secrezione di muco all'interno del lume e la proliferazione iec nelle cripte del colon, come indicato dalla colorazione KI67.
Questi risultati hanno mostrato che il sistema di coltura intestinale mantiene la funzione e la struttura intestinale ex-vivo. Dopo due ore di introduzione di batteri filamentosi segmentati, o SFB, i tipici filamenti SFB sono stati rilevati in stretta associazione con i villi dell'intestino tenue utilizzando l'ibridazione fluorescente in situ. Inoltre, una microscopia elettronica a trasmissione ha presentato SFB entro pochi micron dal bordo del pennello dell'epitelio dell'intestino tenue.
I profili di espressione genica di campioni di tessuto intero sono stati prodotti in triplice copia due ore dopo l'infusione con SFB. Le colture di controllo sono state infuse con sospensioni fecali di topi monocolonizzati privi di germi o Bacteroides fragilis. Questi cambiamenti persuasi da SFB erano principalmente di piccola ampiezza rispetto al controllo privo di germi.
L'orientamento del colon è molto importante. Prestare particolare attenzione quando si lega il colon sull'ago. Una corretta cravatta impedirà la contaminazione del pozzo con il contenuto di lumen.
Una vasta gamma di tecniche di lettura può seguire questo protocollo, come il sequenziamento di nuova generazione, l'imaging, l'ordinamento cellulare e molti altri. Queste leggi forniscono nuove informazioni sulle interazioni del microbioma dell'ospite in salute e malattia.
